周云，方超，王麗，祁碧玉，金香玉，楊世龍，譚小東

安徽智飛龍科馬生物制藥有限公司，安徽合肥230088

流感病毒引起的流行性感冒是人類每年面臨的全球性危害之一，控制流感暴發(fā)和傳播主要依靠接種疫苗。已上市的流感疫苗無(wú)法產(chǎn)生廣譜抗體，病毒血凝素（hemagglutinin，HA）會(huì)快速漂變。WHO PPC（WHO Preferred Product Characteristics）于2017 年對(duì)下一代流感疫苗開發(fā)提出了新的目標(biāo)：2027 年的流感疫苗針對(duì)甲型流感的持續(xù)保護(hù)至少達(dá)5 年［1］。因此，新型流感疫苗的開發(fā)和研制迫在眉睫。

目前，新型流感疫苗的抗原設(shè)計(jì)主要考慮蛋白保守序列，常用的靶點(diǎn)包括：HA 頭部和莖部結(jié)構(gòu)域、M2 蛋白胞外離子通道（extracellular ion channel of M2 protein，M2e）、核蛋白（nucleoprotein，NP）和基質(zhì)蛋白M1［2］。流感融合蛋白候選疫苗M-001 由HA、M1、NP的9 個(gè)抗原表位組成，一項(xiàng)Ⅰ期臨床研究的結(jié)果顯示，其可激發(fā)CD4+和CD8+淋巴細(xì)胞活性，促進(jìn)IL-2和干擾素γ 的分泌［3］；使用初免-加強(qiáng)策略的Ⅱ期臨床研究中，用M-001 初免可顯著增強(qiáng)季節(jié)性流感疫苗（TIV）和H5N1 型流感疫苗的血凝抑制反應(yīng)［4-5］。類似的候選疫苗Flu-V 由M1、M2、NP 和PB1 相關(guān)的6 個(gè)保守抗原表位融合而成，含佐劑Montanide ISA-51，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生HLA-A*0201 介導(dǎo)的CD8+T 細(xì)胞免疫反應(yīng)，保護(hù)小鼠免于致死劑量A／Puerto Rico／8 ／34 毒株攻毒而死亡［6］。

本研究采用人流感病毒HA、NP、基質(zhì)蛋白M1抗原表位融合蛋白（FP），分別輔以氫氧化鋁、聚肌胞（PolyIC）+ 氫氧化鋁和陽(yáng)離子佐劑免疫小鼠，通過(guò)檢測(cè)甲、乙型流感病毒血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）抗體和HA IgG 抗體水平，比較其在小鼠體內(nèi)對(duì)季節(jié)性流感疫苗毒株免疫原性的影響。

1 材料與方法

1.1 抗原及佐劑 抗原FP 為9 個(gè)抗原表位連接后重復(fù)5 次融合而成，參照文獻(xiàn)［3］設(shè)計(jì)并優(yōu)化后用于CHO 細(xì)胞表達(dá)，基因序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，交付產(chǎn)品為重組pUC57 質(zhì)粒；氫氧化鋁佐劑購(gòu)自德國(guó)Brenntag 公司；生理鹽水購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；陽(yáng)離子佐劑和PolyIC 佐劑由本公司自制。

1.2 疫苗及標(biāo)準(zhǔn)品 四價(jià)流感病毒裂解疫苗（QIV）為本公司試制，采用2019 ／ 2020 流感季北半球推薦毒株（H1N1 型毒株：IVR-190，H3N2 型毒株：NYMC X-327，B ／ Y 型毒株：B ／ phuket ／ 3073 ／ 2013，B ／ V型毒株：NYMC BX-69A，均購(gòu)自NIBSC）；檢測(cè)用2019 ／2020 流感季H1N1 型IVR-190、H3N2 型NYMC X-327、B ／ Y 型B ／ phuket ／ 3073 ／ 2013、B ／ V 型NYMC BX-69A 和2018 ／ 2019 流感季H3N2 型IVR-186 抗原標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自NIBSC。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB／c 小鼠50 只，雌性，6 ～8 周齡，體重18 ～ 22 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。動(dòng)物合格證號(hào)：1107262011001571。

1.4 細(xì)胞、載體及菌株 CHO-S 細(xì)胞和pCEP4 載體購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；感受態(tài)大腸埃希菌DH5α購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。

1.5 主要試劑 無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；Plasmid Midi Kit 購(gòu)自美國(guó)OMEGA 公司；限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ購(gòu)自日本TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶購(gòu)自寶日醫(yī)生物科技有限公司；酶切產(chǎn)物純化回收試劑盒Easy Pure Quick Gel Extraction Kit 購(gòu)自全式金生物技術(shù)有限公司；OPTI-MEM 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；鼠源HA Tag（YPYDVPDYA）單克隆抗體購(gòu)自武漢三鷹生物科技有限公司；脫脂乳粉購(gòu)自美國(guó)BBI Life Sciences 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；顯色液、終止液和Tween-20 購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.6 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 將合成的重組質(zhì)粒pUC57-FP 用Hind Ⅲ和XhoⅠ雙酶切，目的基因膠回收后連接至pCEP4 表達(dá)載體，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCEP4-FP。參照質(zhì)粒抽提試劑盒說(shuō)明書提取質(zhì)粒，酶切后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及FP 蛋白表達(dá)的鑒定 采用Western blot 法［7］。將序列驗(yàn)證無(wú)誤的pCEP4-FP 質(zhì)粒線性化后轉(zhuǎn)染至CHO-S 細(xì)胞，48 h 后收集上清和細(xì)胞，制備樣品，Western blot 檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)：FP 蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE 分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的PBST 37 ℃封閉1 h；加入鼠源HA Tag 單克隆抗體（1∶1 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌3 次，每次10 min，加入羊抗鼠IgGHRP（1∶5 000 稀釋），37 ℃孵育1 h；PBST 洗滌5次，每次10 min，加入HRP 顯色液，暗處顯色5 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.8 動(dòng)物免疫 將小鼠按體重隨機(jī)分為5 組：陰性對(duì)照組、抗原組和配伍1、2、3 組，每組10 只，分別于第0、14 天經(jīng)頸部皮下依次注射0.2 mL 生理鹽水、FP 蛋白、FP 蛋白+ 鋁佐劑、FP 蛋白+ 陽(yáng)離子佐劑和FP 蛋白+ PolyIC + 鋁佐劑，每只小鼠FP 蛋白抗原使用劑量為5 μg，佐劑使用劑量為鋁佐劑20 μg、PolyIC 100 μg、陽(yáng)離子佐劑0.1 mL；第28 天使用0.5 mL QIV 經(jīng)腹腔加強(qiáng)免疫1 針。第28 天免疫前及第42 天每組各取5 只小鼠，眼球摘除采血，分離血清，檢測(cè)HI 抗體效價(jià)或HA IgG 抗體。

1.9 H I抗體檢測(cè) 參照文獻(xiàn)［3］，采用血凝抑制法檢測(cè)QIV 對(duì)應(yīng)4 種型別毒株（2019 ／ 2020 流感季，同源株）或IVR-186（2018 ／ 2019 流感季，非同源株）的HI 抗體效價(jià)，其中HI 抗體效價(jià)小于1∶10 的按照1∶5 計(jì)，并計(jì)算HI 抗體效價(jià)幾何平均數(shù)（GMT）、GMT 增長(zhǎng)倍數(shù)及陽(yáng)轉(zhuǎn)率。

1.10 H A IgG 檢測(cè) 采用ELISA 法。每組小鼠血清混合后檢測(cè)，重復(fù)3 次。分別采用H3N2 型病毒NYMC X-327（2019 ／ 2020 流感季，同源株）或IVR-186（2018 ／ 2019 流感季，非同源株）HA 蛋白包被酶標(biāo)板過(guò)夜，加入小鼠血清（1 ∶1 000 稀釋），37 ℃作用1 h；洗板后，加入HRP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG（1 ∶5 000 稀釋），37 ℃作用1 h；PBST 洗板后，37 ℃作用10 min 顯色，加入終止液，在酶標(biāo)儀450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。QIV 免疫后與免疫前A450的比值記為HA IgG 抗體滴度增長(zhǎng)倍數(shù)。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Graphpadprism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間差異的比較采用One way ANOVA檢驗(yàn)，陽(yáng)轉(zhuǎn)率比較采用卡方檢驗(yàn)，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 重組表達(dá)質(zhì)粒pCEP4-FP 經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，可見3 130 bp 的目的基因條帶和10 180 bp 的載體條帶，大小與預(yù)期一致，見圖1。測(cè)序后得到3 130 bp 大小的核苷酸序列，與設(shè)計(jì)的理論基因序列完全一致，表明重組真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒pCEP4-FP 的雙酶切（HindⅢ／ XhoⅠ）鑒定Fig.1 Restriction map of recombinant plasmid pCEP4-FP（HindⅢ／ XhoⅠ）

2.2 FP 蛋白的W estern blot鑒定 結(jié)果顯示，融合蛋白FP 相對(duì)分子質(zhì)量約為110 000，大小與預(yù)期一致，對(duì)照CHO-S 細(xì)胞未見特異性條帶，見圖2。

2.3 H 1N 1 型H I抗體效價(jià) QIV 免疫前，所有小鼠均未檢出HI 抗體。QIV 免疫后，各組均產(chǎn)生針對(duì)H1N1 型HI 抗體，配伍1、2、3 組HI 效價(jià)GMT 分別為1 ∶184、1 ∶243 和1 ∶184，各組GMT 增長(zhǎng)倍數(shù)在24.25 ～ 48.50 之間；配伍2 組的HI 效價(jià)和GMT增長(zhǎng)倍數(shù)均明顯高于陰性對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =2.970，P =0.018 7）；各組HI 抗體效價(jià)陽(yáng)轉(zhuǎn)率均達(dá)100%。見表1。

圖2 融合蛋白FP 的Western blot 分析Fig.2 Western blotting of FP

表1 各組小鼠H1N1 型毒株HI 抗體效價(jià)Tab.1 HI antibody titers against H1N1 virus strain

2.4 H 3N 2 型H I抗體效價(jià) QIV 免疫前，所有小鼠均未檢出HI 抗體。QIV 免疫后，各組均產(chǎn)生針對(duì)H3N2 型HI 抗體，配伍1、2、3 組HI 效價(jià)GMT 分別為1 ∶35、1 ∶53 和1 ∶35；各組GMT 增長(zhǎng)倍數(shù)在5.28 ～ 10.56 之間，配伍2 組高于陰性對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =2.086，P =0.050 6）；各組在QIV 免疫后HI 抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率均有所上升，其中配伍2 組陽(yáng)轉(zhuǎn)率達(dá)100%，明顯高于陰性對(duì)照組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.285 7，P =0.000 2）。見表2。

表2 各組小鼠H3N2 型毒株HI 抗體效價(jià)Tab.2 HI antibody titers against H3N2 virus strain

2.5 B／V 型H I抗體效價(jià) QIV 免疫前，所有小鼠均未檢出HI 抗體。QIV 免疫后，各組均產(chǎn)生針對(duì)B ／ V 型HI 抗體，配伍1、2、3 組HI 效價(jià)GMT 分別為1 ∶61、1 ∶61 和1 ∶46；各組GMT 增長(zhǎng)倍數(shù)在8.8～12.8 之間；HI 抗體效價(jià)陽(yáng)轉(zhuǎn)率在80% ～ 100%之間，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =1.258，P =0.322 2）。見表3。

表3 各組小鼠B ／ V 型毒株HI 抗體效價(jià)Tab.3 HI antibody titers against B ／ V virus strain

2.6 B／Y 型H I抗體效價(jià) QIV 免疫前，所有小鼠均未檢出HI 抗體。QIV 免疫后，各組均產(chǎn)生針對(duì)B ／ Y型HI 抗體，配伍1、2、3 組HI 效價(jià)GMT 分別為1 ∶121、1 ∶121 和1 ∶92；各組GMT 增長(zhǎng)倍數(shù)在14.25 ～22.63 之間，組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =1.107，P =0.380 6）；各組HI 抗體效價(jià)陽(yáng)轉(zhuǎn)率均達(dá)100%。見表4。

表4 各組小鼠B ／ Y 型毒株HI 抗體效價(jià)Tab.4 HI antibody titers against B ／ Y virus strain

2.7 非同源株H 3N 2 型H I抗體效價(jià) QIV 免疫前，所有小鼠均未檢出HI 抗體。QIV 免疫后，各組均產(chǎn)生針對(duì)H3N2 型HI 抗體，HI 效價(jià)GMT、GMT 增長(zhǎng)倍數(shù)各組之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =1.600，P =0.213 2）。見表5。

2.8 兩株H 3N 2 型H A IgG ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，配伍2 組小鼠血清中同源株H3N2 型HA IgG 抗體滴度增長(zhǎng)倍數(shù)明顯高于陰性對(duì)照和其余各組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =166.7，P＜0.000 1）。非同源株檢測(cè)結(jié)果顯示，配伍2 組明顯高于陰性對(duì)照和配伍1 組，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=25.37，P＜0.000 1和=0.003 5）；高于抗原組和配伍3 組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F =25.37，P分別為0.052 6 和0.051）。非同源株HA IgG 增長(zhǎng)趨勢(shì)與HI 抗體滴度結(jié)果（表5）不完全一致。見表6。

表5 各組小鼠H3N2 型毒株HI 抗體效價(jià)Tab.5 HI antibody titers against H3N2 virus strain

表6 H3N2 型毒株HA IgG 增長(zhǎng)倍數(shù)Tab.6 Increasing fold of HA IgG titer against H3N2 virus strain

3 討 論

本研究選擇3 種已上市或多次用于人體臨床研究的佐劑氫氧化鋁、PolyIC + 氫氧化鋁和陽(yáng)離子佐劑，用于輔佐流感病毒抗原表位融合蛋白。鋁佐劑最早批準(zhǔn)用于人體，也是目前應(yīng)用最廣泛的無(wú)機(jī)鹽佐劑，有不少于10 種疫苗含有鋁佐劑［8］。PolyIC 作為TLR3 的配體佐劑，具有強(qiáng)效激活先天免疫的優(yōu)勢(shì)，以PolyIC 為主要成分的PIKA 佐劑用于狂犬病疫苗的臨床研究顯示，其可加速疫苗達(dá)到有效標(biāo)準(zhǔn)（抗體不低于0.5 IU ／ mL）［9］。陽(yáng)離子佐劑系統(tǒng)二甲基雙十八烷基銨／ 海藻糖6，6，9-二山崳酸酯在小鼠體內(nèi)可誘導(dǎo)高效的黏膜免疫和全身抗體反應(yīng)［10］，人體臨床研究表明，該佐劑還可激發(fā)強(qiáng)有力的T 細(xì)胞免疫應(yīng)答［11］。

傳統(tǒng)流感疫苗的免疫保護(hù)效果依據(jù)HI 抗體結(jié)果判斷，而新型流感疫苗涉及更多的細(xì)胞免疫途徑，現(xiàn)有的流感疫苗有效性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)無(wú)法適用。本研究在抗原和佐劑初次免疫后，使用QIV 加強(qiáng)免疫，通過(guò)檢測(cè)小鼠血清HI 抗體效價(jià)或HA IgG 抗體水平判斷其免疫原性，結(jié)果顯示，佐劑與抗原本身并不產(chǎn)生針對(duì)任何型別的HI 抗體；抗原+ 陽(yáng)離子佐劑+ QIV免疫后，顯著提高了QIV 同源株H1N1 和H3N2 型HI 抗體效價(jià)或陽(yáng)轉(zhuǎn)率，且可促進(jìn)非同源的H3N2 型HA IgG 抗體產(chǎn)生，但試驗(yàn)組血清并未顯示出明顯的非同源株的HI 抗體升高，HA IgG 抗體增長(zhǎng)趨勢(shì)與HI 抗體滴度并不一致。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［12］，針對(duì)非同源株交叉保護(hù)可見HA IgG 抗體的增加，但無(wú)法通過(guò)HI 抗體結(jié)果反映。本研究中，HA IgG 抗體的增加是否與交叉保護(hù)有關(guān)，尚需通過(guò)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，陽(yáng)離子佐劑輔助流感病毒抗原表位融合蛋白免疫小鼠后，可顯著增強(qiáng)季節(jié)性流感疫苗甲型毒株的免疫原性，為后期新型流感疫苗的研制提供了參考。