夏天，韓海霞，馮偉，方麗君，付霞

（1.應城市人民醫(yī)院急診科，湖北應城 432400；2.武漢市第六醫(yī)院江漢大學附屬醫(yī)院急診科，湖北武漢 430015）

胰腺癌，是最常見的惡性腫瘤之一，由于缺乏早期診斷和治療方案，其發(fā)病率大致接近死亡率[1]。近年來胰腺癌的發(fā)病率逐漸增加，主要是由于肥胖、吸煙、酗酒、既往慢性胰腺炎和既往腹部放療的增加所致[2]。因胰腺癌具有高侵襲和轉移性，大約80%的胰腺癌患者被診斷為不可切除的形式[3]。胰腺癌轉移常常發(fā)生于腫瘤的早期階段，即使是表面上腫瘤可切除的胰腺癌患者，也往往不能通過手術治愈，因為在手術之前，顯微鏡下便可觀察到癌癥已經(jīng)全身擴散[4]。目前，對不能手術治療的患者仍然局限于化療、放療或兩者兼用[5]。因此，迫切需要更全面、有效的治療策略。重樓為百合科植物云南重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.或七葉一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara的干燥根莖；味苦，性寒，有小毒；入心、肝經(jīng)；具有清熱解毒、消腫止痛、涼肝定驚的功效，用于疔腫癰腫、咽喉腫痛、毒蛇咬傷等病癥。重樓皂苷Ⅶ是提取自中藥重樓的一種甾體皂苷，可抑制癌細胞增殖、癌細胞周期停滯和調(diào)節(jié)癌細胞耐藥性，已被證明具有很強的抗癌活性，涉及肝癌HepG2細胞、宮頸癌Hela細胞、乳腺癌MCF-7細胞和結直腸癌HT-29細胞等[6-9]。為進一步觀察重樓皂苷Ⅶ對胰腺癌的抗癌作用，本研究探討了重樓皂苷Ⅶ對裸鼠胰腺癌移植瘤生長的影響及其機制，以期為其臨床治療胰腺癌提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物50只4～6周齡雄性Balb/c裸鼠，體質量為（16±2）g，無特定病原體（specific-pathogen free，SPF）級別，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0008，于河南省實驗動物中心SPF級別動物飼養(yǎng)房飼養(yǎng)，實驗單位使用許可證編號：SYXK（豫）2016-0002。

1.2 藥物、試劑與儀器重樓皂苷Ⅶ（批號：111593-201604；化學式：C51H82O21；分子量：1031.18；純度≥94.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；5-氟尿嘧啶（批號：B25419）購自上海源葉生物科技有限公司。末端脫氧核苷酸轉移酶介導的d UTP缺口末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白、GAPDH等抗體購自英國Abcam公司。游標卡尺購自南京智睿生物科技有限公司；Ti2熒光顯微鏡購自日本尼康株式會社。

1.3 動物模型建立[10]、分組與給藥將人胰腺癌細胞系AsPC-1[購自美國模式培養(yǎng)物保藏所（ATCC）]皮下注射裸鼠，構建異種移植瘤模型。2周后待腫瘤體積長到約100 mm3時，將裸鼠隨機分為5組，即對照組，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組和5-氟尿嘧啶組，每組各10只。對照組：每日灌胃0.3 mL生理鹽水，持續(xù)30 d；重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組：每日分別灌胃重樓皂苷Ⅶ混懸液（對應劑量為5、10、20 mg/kg）0.3 mL，持續(xù)30 d；5-氟尿嘧啶組：每日灌胃5-氟尿嘧啶混懸液（劑量為17 mg/kg）0.3 mL，持續(xù)30 d。

1.4 測量移植瘤體積與質量30 d后處死裸鼠，切取移植瘤，稱取移植瘤質量，用游標卡尺測量移植瘤長徑a（mm）和短徑b（mm），移植瘤體積=a×b2/2。

1.5 TUNEL法測定移植瘤組織細胞凋亡情況將移植瘤組織用體積分數(shù)10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，厚度為4μm。將石蠟切片脫蠟處理，滴加20μg/mL蛋白酶K，20～37℃作用20 min。用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次，加入50μL TUNEL檢測液，37℃避光孵育60 min。用PBS洗滌1次，滴加0.2 mL標記反應終止液，室溫孵育10 min。用PBS洗滌3次，繼續(xù)在樣品上加50μL Streptavidin-HRP工作液，室溫孵育30 min。用PBS洗滌3次，最后滴加0.3 mL 3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液后在熒光顯微鏡下觀測。

1.6 蛋白免疫印跡法檢測胰腺癌裸鼠移植瘤組織Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達水平取裸鼠移植瘤組織，以4℃預冷的PBS清洗3次，加入裂解液提取總蛋白，用二喹啉甲酸（BCA）試劑盒測定蛋白含量。取適量樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，用體積分數(shù)5%牛血清白蛋白（BSA）4℃封閉4 h，加入一抗（分別為Caspase-3、Bax、Bcl-2抗體）孵育過夜，清洗后再加入二抗孵育1 h，最后加入發(fā)光液曝光、顯影。用ImageJ軟件分析灰度值計算目的蛋白的相對表達量，以GAPDH為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。首先分析正態(tài)分布和方差齊性，符合條件的數(shù)據(jù)采用單因素方差分析或t檢驗，不符合條件的數(shù)據(jù)則采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 重樓皂苷Ⅶ降低胰腺癌裸鼠移植瘤體積圖1結果顯示：重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組和5-氟尿嘧啶組胰腺癌裸鼠移植瘤體積均顯著低于對照組（P＜0.01），且重樓皂苷Ⅶ的降低作用呈劑量依賴性。

圖1 各組胰腺癌裸鼠移植瘤體積比較Figure 1 Comparison of the volume of xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice

2.2 重樓皂苷Ⅶ降低胰腺癌裸鼠移植瘤質量表1結果顯示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組和5-氟尿嘧啶組胰腺癌裸鼠移植瘤質量均顯著降低（P＜0.01），且重樓皂苷Ⅶ的降低作用呈劑量依賴性。

表1 各組胰腺癌裸鼠移植瘤質量比較Table 1 Comparison of the mass of xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice（±s）

①P＜0.01，與對照組比較

組別對照組重樓皂苷Ⅶ低劑量組重樓皂苷Ⅶ中劑量組重樓皂苷Ⅶ高劑量組5-氟尿嘧啶組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10移植瘤質量（g）0.50±0.03 0.40±0.05①0.24±0.03①0.11±0.03①0.06±0.02①

2.3 重樓皂苷Ⅶ促進胰腺癌裸鼠移植瘤組織細胞凋亡移植瘤組織TUNEL陽性表達細胞胞核呈棕色深染，結果如圖2所示。表2結果顯示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組和5-氟尿嘧啶組胰腺癌裸鼠移植瘤組織TUNEL陽性細胞比例均顯著升高（P＜0.01），且重樓皂苷Ⅶ的升高作用呈劑量依賴性。

圖2 各組胰腺癌裸鼠移植瘤組織TUNEL陽性細胞分布（TUNEL染色法，×200）Figure 2 Comparison of the distribution of TUNEL positive cells in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice（by TUNEL staining，×200）

表2 各組胰腺癌裸鼠移植瘤組織TUNEL陽性細胞比例比較Table 2 Comparison of proportion of TUNEL positive cells in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

表2 各組胰腺癌裸鼠移植瘤組織TUNEL陽性細胞比例比較Table 2 Comparison of proportion of TUNEL positive cells in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

①P＜0.01，與對照組比較

組別對照組重樓皂苷Ⅶ低劑量組重樓皂苷Ⅶ中劑量組重樓皂苷Ⅶ高劑量組5-氟尿嘧啶組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 TUNEL陽性細胞比例（%）2.1±0.3 8.8±0.9①19.5±2.3①36.1±4.2①45.3±4.8①

2.4 重樓皂苷Ⅶ上調(diào)胰腺癌裸鼠移植瘤組織Caspase-3、Bax蛋白表達，下調(diào)Bcl-2蛋白表達

表3、圖3結果顯示，與對照組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組和5-氟尿嘧啶組胰腺癌裸鼠移植瘤組織Caspase-3、Bax蛋白水平均顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白水平均顯著降低（P＜0.01），且重樓皂苷Ⅶ對Caspase-3、Bax蛋白的升高作用或對Bcl-2蛋白的降低作用呈劑量依賴性。

圖3 各組胰腺癌裸鼠移植瘤組織Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白免疫印跡電泳條帶Figure 3 Comparison of Western blotting strips of caspase-3，Bax and Bcl-2 in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice

表3 各組胰腺癌裸鼠移植瘤組織Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the expression levels of Caspase-3，Bax and Bcl-2 proteins in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

表3 各組胰腺癌裸鼠移植瘤組織Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達水平比較Table 3 Comparison of the expression levels of Caspase-3，Bax and Bcl-2 proteins in xenografts between various groups of pancreatic cancer nude mice （±s）

①P＜0.01，與對照組比較

組別對照組重樓皂苷Ⅶ低劑量組重樓皂苷Ⅶ中劑量組重樓皂苷Ⅶ高劑量組5-氟尿嘧啶組鼠數(shù)（只）10 10 10 10 10 Caspase-3/GAPDH相對表達量0.08±0.01 0.23±0.04①0.51±0.10①1.02±0.05①1.22±0.03①Bax/GAPDH相對表達量0.10±0.02 0.25±0.04①0.43±0.05①0.98±0.12①1.31±0.11①Bcl-2/GAPDH相對表達量0.86±0.09 0.55±0.07①0.45±0.05①0.22±0.03①0.10±0.02①

3 討論

胰腺癌形成目前被認為是受多因素、多基因、多步驟調(diào)控，內(nèi)外因相互作用的復雜過程[11]。胰腺癌的5年生存率＜5%，中位生存期不到6個月[12]。雖然，目前對胰腺癌的流行病學、發(fā)病機制和診斷治療有了更深入的了解，但各種治療方法的效果差，主要是因為胰腺解剖、生理特點的特殊性，早期發(fā)現(xiàn)和手術切除困難，化療不敏感[13]。5-氟尿嘧啶是最早用于治療胰腺癌的化療藥物，但5-氟尿嘧啶的耐藥性在臨床上廣泛存在[14]。因此，需要探尋新型有效的抗胰腺癌藥物。中藥是用于治療癌癥的最常用的補充和替代藥物之一[15-17]。中藥重樓常用于治療癌癥[18]，其生物活性成分主要為多種甾體皂苷類。從中分離得到的重樓皂苷Ⅶ已被證明具有很強的抗癌活性[6-9，19]。

細胞凋亡是程序性細胞死亡的過程，在人類發(fā)育和組織穩(wěn)態(tài)中起重要作用。越來越多的證據(jù)表明細胞凋亡與癌癥的存活密切相關，已成為發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新型抗癌藥物的關鍵目標[20]。研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，通過促進細胞凋亡可抑制胰腺癌細胞的生長。本研究結果顯示，重樓皂苷Ⅶ可降低裸鼠移植瘤體積、質量，促進裸鼠移植瘤細胞凋亡，表明重樓皂苷Ⅶ對胰腺癌裸鼠移植瘤生長具有抑制作用。

細胞凋亡分為外源性凋亡途徑、內(nèi)源性凋亡途徑和內(nèi)質網(wǎng)應激途徑[23]。Caspase家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件，可以通過與眾多蛋白因子的相互作用調(diào)控細胞凋亡，Caspase家族成員Caspase-3是細胞凋亡過程中的主要效應因子[24]。蒲鳳萍等[25]研究發(fā)現(xiàn)，升高Caspase-3活性可促進胰腺癌細胞凋亡。本研究結果表明，重樓皂苷Ⅶ能上調(diào)胰腺癌裸鼠移植瘤組織Caspase-3蛋白的表達。

內(nèi)在凋亡途徑中的關鍵事件是線粒體外膜的透化，其響應于各種刺激而發(fā)生，并且受若干細胞質蛋白調(diào)節(jié)，包括Bcl-2家族成員[26]?？辜毎蛲龀蓡TBcl-2，可防止細胞凋亡；而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細胞質，并在應激下寡聚化，促進線粒體釋放因子，從而引發(fā)細胞凋亡[27]。Zhang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Bcl-2蛋白表達、上調(diào)Bax蛋白表達可促進BxPc-3人胰腺癌細胞凋亡。王云檢等[29]研究發(fā)現(xiàn)，促進Bax表達、降低Bcl-2/Bax的比值可對裸鼠胰腺癌皮下移植瘤有促凋亡作用。本研究結果表明，重樓皂苷Ⅶ能上調(diào)胰腺癌裸鼠移植瘤組織Bax、下調(diào)Bcl-2蛋白表達。

綜上所述，重樓皂苷Ⅶ可有效抑制裸鼠胰腺癌移植瘤的生長，其機制可能與上調(diào)Caspase-3、Bax蛋白表達、下調(diào)Bcl-2蛋白表達、從而促進細胞凋亡有關。本研究結果展示了重樓皂苷Ⅶ治療胰腺癌的潛力，該藥值得進一步深入研究和挖掘，尤其是要針對其耐藥性監(jiān)測的問題。