王興瑜

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040

骨骼肌結(jié)節(jié)處存在大量高度異常敏感小點(diǎn)即為肌筋膜激痛點(diǎn)(myofascial trigger points，MTrPs)，經(jīng)觸診發(fā)現(xiàn)該處存在一條緊繃肌帶[1]。隱性激痛點(diǎn)在受到創(chuàng)傷、免疫力下降、疲勞、機(jī)體姿勢(shì)長(zhǎng)期失衡及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏等刺激會(huì)轉(zhuǎn)化為活化激痛點(diǎn)，從而導(dǎo)致關(guān)節(jié)功能受限、骨骼肌疼痛、自主神經(jīng)功能紊亂及感覺(jué)異常等，甚至導(dǎo)致患者肢體功能喪失[2]。已有學(xué)者指出，對(duì)MTrPs進(jìn)行針刺可起到滅活作用，通過(guò)觀察患者疼痛改善情況、疼痛閾值、關(guān)節(jié)活動(dòng)度及焦慮、抑郁指數(shù)等進(jìn)行多方面證實(shí)，確定針刺MTrPs可起到良好效果[3]。采用體外沖擊波干預(yù)，同樣可起到治療肌筋膜疼痛的作用。雖然已有大量學(xué)者投身于鎮(zhèn)痛激痛點(diǎn)的研究，但關(guān)于該治療的機(jī)理仍無(wú)統(tǒng)一定論，且現(xiàn)有研究主要集中在組織形態(tài)學(xué)及肌電生理學(xué)方面，關(guān)于分子生物層面的研究相對(duì)較少[4]。體外沖擊波的治療機(jī)制雖已明確，但是關(guān)于體外沖擊對(duì)激痛點(diǎn)是如何發(fā)揮作用的研究卻相對(duì)較少。本研究通過(guò)制備大鼠MTrPs模型，采用不同方式進(jìn)行干預(yù)，分析針刺及電沖擊波對(duì)大鼠海馬Smad4和TGF-β1蛋白表達(dá)的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物6周齡SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量220～250 g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SYXK(滬)2014-0002。飼養(yǎng)條件：溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，每日保持12 h的固定明暗周期。

1.2 試劑Smad4抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：XY-E30413)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)抗體(美國(guó)Abcam公司，批號(hào)：XY-E30026)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(美國(guó)ThermalScientific公司，批號(hào)：BC-WB-005-500T)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司，批號(hào)：15596-026)；RNA-freeWater(德國(guó)QIAGEN公司，批號(hào)：129112)。

1.3 儀器MutiscanGo型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)；TissueRuptor型勻漿器(北京鼎昊源公司)；GIS-1600型凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；電泳槽和電泳儀(美國(guó)BIORAD公司)；熱循環(huán)儀(美國(guó)LIFE公司)。

2 方法

2.1 模型制備與給藥大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行模型制備。將大鼠隨機(jī)分為6組，每組10只，即空白組、模型組、針刺激痛點(diǎn)組、針刺非激痛點(diǎn)組、電沖擊波組、針刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組。除空白組外，其余大鼠復(fù)制MTrPs模型。每周第1天對(duì)大鼠進(jìn)行打擊處理，將其固定在自制模型上，取仰臥位，對(duì)標(biāo)記部位垂直打擊，用質(zhì)量為1200 g的打擊器，選擇20 cm自由落體運(yùn)動(dòng)完成打擊，動(dòng)能約2.4 J，與大鼠腓腸肌接觸面積約1 cm2，打擊部位為大鼠左后肢腓腸肌中端偏上0.5～1 cm位置，導(dǎo)致該位置出現(xiàn)鈍挫傷。打擊后第2天對(duì)大鼠進(jìn)行跑臺(tái)離心運(yùn)動(dòng)，讓其完成持續(xù)性下坡跑訓(xùn)練，該訓(xùn)練在傾斜角為-16°的電動(dòng)動(dòng)物跑臺(tái)上進(jìn)行，逐漸增加跑臺(tái)轉(zhuǎn)速，直至升至16 m·s-1，每次跑臺(tái)訓(xùn)練時(shí)間為90 min，訓(xùn)練期間研究人員可采用聲音、木棒等對(duì)大鼠進(jìn)行刺激，保證其進(jìn)行良好的運(yùn)動(dòng)。在后續(xù)5 d內(nèi)對(duì)大鼠正常喂養(yǎng)，重復(fù)以上操作，進(jìn)行為期8周的重復(fù)后，進(jìn)入為期4周的修復(fù)期，修復(fù)期大鼠正常喂養(yǎng)，干預(yù)12周后完成MTrPs模型創(chuàng)建。采用國(guó)際公認(rèn)MTrPs存在特征對(duì)動(dòng)物模型建立成功與否進(jìn)行判斷。首先剔除大鼠后肢毛發(fā)，對(duì)造模部位觸診，可觀察到大鼠左后肢造模部位存在攣縮結(jié)節(jié)，在結(jié)節(jié)處刺入第1支電極針，觀察到存在肌肉跳動(dòng)情況，在第1根電極針旁3～5 mm 處將另一電極針刺入作為參考電極，進(jìn)行肌電裝置連接，觀察大鼠肌電活動(dòng)情況，時(shí)間為 1 min，造模成功時(shí)會(huì)存在高頻自發(fā)性電位，對(duì)該期間頻率的波頻、波幅及波長(zhǎng)詳細(xì)記錄。

2.2 各組干預(yù)措施空白組大鼠不進(jìn)行任何處理；模型組大鼠僅進(jìn)行造模處理，但在完成造模后不對(duì)該組大鼠進(jìn)行針刺或(和)電沖擊波處理；針刺激痛點(diǎn)組大鼠在造模成功后進(jìn)行針刺干預(yù)，對(duì)大鼠左后肢常規(guī)消毒，取針灸針對(duì)大鼠腓腸肌的4處激痛點(diǎn)針刺刺激，采用分層次提插方式，對(duì)相應(yīng)的疼痛激痛點(diǎn)尋找，并內(nèi)外上下4個(gè)方向進(jìn)行滅活，在找準(zhǔn)激痛點(diǎn)后，可觀察到該部位肌肉出現(xiàn)抽搐顫動(dòng)狀，進(jìn)行中等強(qiáng)度針刺，顫動(dòng)次數(shù)為6次時(shí)出針，本次針刺治療結(jié)束；針刺非激痛點(diǎn)組同樣對(duì)其左后肢常規(guī)消毒，對(duì)腓腸肌的4處激痛點(diǎn)旁1～2 cm處針刺，觀察進(jìn)針后大鼠未發(fā)生肌肉顫動(dòng)情況，同樣為中等強(qiáng)度針刺，進(jìn)行6次分層次提插后將針取出，治療結(jié)束；體外沖擊波組在完成造模后進(jìn)行4周正常飼養(yǎng)，對(duì)大鼠麻醉后，在大鼠右股內(nèi)側(cè)肌處涂沫耦合劑，采用沖擊波治療儀(storzMP100型，瑞典)對(duì)其進(jìn)行沖擊波治療，探頭選擇F15，劑量0.16 Mj·mm-2，沖擊300次，頻率1.3 Hz，每5 d進(jìn)行1次，連續(xù)3次后對(duì)該組大鼠正常飼養(yǎng)；針刺聯(lián)合電沖擊波組在完成針刺后隨即對(duì)其進(jìn)行電沖擊波治療，針刺方案與針刺痛點(diǎn)組一致，電沖擊波方案與電沖擊波組一致，干預(yù)周期均為每周1次治療，共4周。采用腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1)對(duì)大鼠深度麻醉，確定其完全麻醉后，取其仰臥位，對(duì)股內(nèi)側(cè)肌解剖分離，取 1 cm3左右的組織切塊，放入4%的多聚甲醛固定，無(wú)菌操作下剝離腦組織分離海馬部分，用預(yù)冷的 PBS 洗滌去除殘留血液和污染物，沖洗干凈[5]，立即置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹6]。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 免疫組織化學(xué)染色采用免疫組織化學(xué)染色對(duì)股內(nèi)側(cè)肌組織切片處理，觀察激痛點(diǎn)局部Smad4和TGF-β1表達(dá)。脫蠟處理，用體積分?jǐn)?shù)為3%的雙氧水滅活后過(guò)氧化酶滴加，時(shí)間 10 min；用微波爐對(duì)其進(jìn)行加熱，在沸騰后停止加熱，自然冷卻，將其置于pH值7.4的0.1 mol·L-1枸櫞酸鈉緩沖液中，時(shí)間10 min；用5%的BSA封固液封固處理在37 ℃下反應(yīng)30 min；滴加兔大鼠Smad4和TGF-β1多克隆抗體，反應(yīng)時(shí)間2 h，用PBS液反復(fù)沖洗，時(shí)間5 min，共3次；加入二抗，37 ℃下反應(yīng) 30 min；用PBS沖洗，時(shí)間5 min，共3次；滴加ASBC溶液，時(shí)間30 min，溫度為37 ℃，用PBS溶液清洗，時(shí)間 5 min，共4次；滴加DAB試劑，顯色在室溫下完成，反應(yīng)時(shí)間15 min，在顯微鏡下控制；用蒸餾水洗滌，復(fù)染采用蘇木精，完成染色后脫水、透明及封固等操作，在光學(xué)顯微鏡下觀察[7]。

2.3.2 Western Blot法對(duì)大鼠海馬中Smad4和TGF-β1的表達(dá)將海馬剪切成碎片，用RIPA裂解液溶解，充分混合，離心半徑8.5 cm，12 000 r·min-1，離心時(shí)間 5 min，分離上層清液，用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，37 ℃，孵育30 min，562 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)量[8]，根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)品濃度計(jì)算樣本總蛋白濃度。每孔加樣液30 μg，電脈后轉(zhuǎn)膜，用封閉液稀釋的GAPDH、Smad4及TGF-β1進(jìn)行孵育，4 ℃，過(guò)夜；用TBST溶液洗膜，沖洗5 min，連續(xù)3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，室溫下孵育2 h，用TBST溶液洗膜，每次 15 min，連續(xù)5次；加入化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，反應(yīng)2 min，將膜取出，甩去多余液體，用保鮮膜包好PVDF膜，在暗室中感光、顯影以及定影[9-10]。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠波頻、波幅及波長(zhǎng)變化結(jié)果分析與空白組相比，模型組波頻、波幅及波長(zhǎng)均顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，針刺激痛點(diǎn)組、電沖擊波組及刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組的波頻、波幅及波長(zhǎng)均顯著降低(P<0.01)，其中刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組大鼠波頻、波幅及波長(zhǎng)下降最為明顯。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠波頻、波幅以及波長(zhǎng)變化結(jié)果分析

3.2 免疫組化法檢測(cè)TGF-β1及Smad4在大鼠股內(nèi)側(cè)肌的表達(dá)空白組大鼠股內(nèi)側(cè)肌內(nèi)Smad4及TGF-β1呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)，僅有少量區(qū)域被染為淡黃色；與空白組相比，模型組和針刺非激痛點(diǎn)組大鼠股內(nèi)側(cè)肌內(nèi)Smad4以及TGF-β1呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，存在大量區(qū)域被染為棕色或棕黃色，光密度明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，針刺激痛點(diǎn)組、電沖擊波組及刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組Smad4及 TGF-β1 表達(dá)明顯下降(P<0.05；P<0.01)。提示采用針刺激痛點(diǎn)聯(lián)合電沖擊波干預(yù)可降低大鼠Smad4及TGF-β1的表達(dá)。見(jiàn)表2，圖1。

注：A：空白組；B：模型組；C：針刺激痛點(diǎn)組；D：針刺非激痛點(diǎn)組；E：電沖擊波組；F：針刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組圖1 TGF-β1及Smad4免疫組化法檢測(cè)結(jié)果

表2 各組大鼠股內(nèi)測(cè)TGF-β1與Smad4的表達(dá)

3.3 Smad4及TGF-β1在大鼠海馬中的表達(dá)與空白組相比，模型組大鼠海馬中Smad4及 TGF-β1 蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組組相比，針刺激痛點(diǎn)組、電沖擊波組及刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組可明顯降低Smad4和TGF-β1蛋白表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)表3，圖2。

表3 TGF-β1及Smad4在大鼠海馬中的表達(dá)

注：A：空白組；B：模型組；C：針刺激痛點(diǎn)組；D：針刺非激痛點(diǎn)組；E：電沖擊波組；F：針刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組圖2 TGF-β1及Smad4在大鼠海馬中的表達(dá)

4 討論

MTrPs的形成和發(fā)生過(guò)程比較復(fù)雜，目前對(duì)該疾病有多種假說(shuō)。其中中樞敏化假說(shuō)認(rèn)為，若不能及時(shí)對(duì)MTrPs進(jìn)行滅活，會(huì)因缺血、缺氧而導(dǎo)致局部刺激物堆積，使神經(jīng)元附近的傷害感受器被激活，造成脊髓后角神經(jīng)元池致敏，反復(fù)放大神經(jīng)信號(hào)，增強(qiáng)神經(jīng)元對(duì)閾值刺激的反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致中樞敏化的發(fā)生，在骨骼肌的反饋表現(xiàn)即為力學(xué)失衡或張力改變[11-13]。海馬是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要組成部分，參與對(duì)傷害性感受信息(如神經(jīng)損傷、炎癥等)的加工、修飾及中樞整合?，F(xiàn)有研究表明，神經(jīng)病理性疼痛可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元發(fā)生減少、體積縮小、突觸可塑性降低等結(jié)構(gòu)的改變[14]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在激痛點(diǎn)局部組織處存在缺血、缺氧，且氧適應(yīng)性、氧耐量明顯降低，從而導(dǎo)致局部?jī)?nèi)循環(huán)灌注不佳情況的發(fā)生[15]。目前有研究發(fā)現(xiàn)，組織會(huì)因?yàn)榈脱醵l(fā)生炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫等，促進(jìn)相關(guān)炎癥因子及纖維化因子表達(dá)，對(duì)纖維細(xì)胞分化可起到促進(jìn)作用[16]。

組織纖維化過(guò)程中TGF-β1/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起著重要作用[17]。經(jīng)臨床證實(shí)，對(duì)患者進(jìn)行針刺治療可降低其炎癥因子水平，使IFN-γ水平上調(diào)、TGF-β1水平下調(diào)對(duì)組織纖維化產(chǎn)生抑制作用[18]。目前體外沖擊波主要用于腎結(jié)石治療，隨著醫(yī)學(xué)研究的不斷拓展，體外沖擊波的應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，在骨折愈合不良、慢性疼痛及肢體康復(fù)治療中，因其治療具有無(wú)創(chuàng)、操作簡(jiǎn)單及不良反應(yīng)小，其療效逐漸得到臨床認(rèn)可[19-20]。關(guān)于體外沖擊波對(duì)MTrPs治療的研究不多，本研究通過(guò)觀察不同干預(yù)方式下大鼠海馬中Smad4及TGF-β1的表達(dá)，分析采用針刺激痛點(diǎn)聯(lián)合電沖擊波治療MTrPs的作用機(jī)制[21]。

TGF-β1對(duì)多種靶基因的表達(dá)可起到調(diào)節(jié)作用，屬于一種多功能多肽，在腸上皮細(xì)胞的分化、轉(zhuǎn)移及增殖等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用，對(duì)炎癥細(xì)胞可起到趨化作用，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化，在細(xì)胞外基質(zhì)生成過(guò)程中同樣發(fā)揮著重要作用[22]。TGF-β1 屬于機(jī)體內(nèi)重要的抗炎因子，對(duì)所有淋巴細(xì)胞的增殖及其功能可起到抑制作用，同時(shí)抑制巨噬細(xì)胞激活，從而促進(jìn)組織修復(fù)[23]。已有研究證實(shí)TGF-β1的抗炎具有雙重作用，在其正常表達(dá)狀態(tài)下，抑制炎癥及細(xì)胞增生，但在其出現(xiàn)過(guò)度表達(dá)情況時(shí)，則可能導(dǎo)致病理性改變，如促進(jìn)組織纖維化等[24]。Smads蛋白是一種重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，對(duì) TGF-β1 家族信號(hào)從受體到核傳遞有著重要的作用，屬于TGF-β1與其受體的重要中介分子，而Smad4是TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)必需的中轉(zhuǎn)分子。已有研究指出，Smad4低表達(dá)可對(duì)成肌細(xì)胞及受 TGF-β1 誘導(dǎo)成肌纖維細(xì)胞的纖維化過(guò)程起到抑制作用[25]。有研究指出，體外沖擊波所產(chǎn)生的機(jī)械效應(yīng)與中醫(yī)推拿相似，可降低肌張力，松懈組織粘連，對(duì)微循環(huán)起到改善作用，抑制疼痛物質(zhì)的釋放[11]。沿激痛點(diǎn)傳播方向由沖擊波導(dǎo)致介質(zhì)出現(xiàn)壓縮與膨脹情況，從而產(chǎn)生機(jī)械應(yīng)力，達(dá)到軟組織松懈及彈性變形[26]。體外沖擊波可有效促進(jìn)局部血管擴(kuò)張，改善局部組織血液循環(huán)，促進(jìn)新組織形成，有利于肌腱恢復(fù)[27]。本研究顯示，針刺激痛點(diǎn)組、電沖擊波組及刺痛點(diǎn)沖擊波結(jié)合組的波頻、波幅及波長(zhǎng)均顯著降低，同時(shí)可顯著下降股內(nèi)側(cè)肌和海馬組織Smad4和TGF-β1的表達(dá)，而采用針刺激痛點(diǎn)聯(lián)合電沖擊波可有效降低Smad4和TGF-β1表達(dá)，從而使激痛點(diǎn)局部纖維得到改善。綜上所述，采用針刺激痛點(diǎn)及聯(lián)合點(diǎn)沖擊波進(jìn)行治療，可降低海馬中Smad4和TGF-β1蛋白表達(dá)，分析其可能與針刺MTrPs的鎮(zhèn)痛機(jī)制存在相關(guān)性。