代航，李延，劉樹春，林磊，吳娟燕，張志杰，彭崎春，李楠，張向前

研究報(bào)告

類伸展蛋白OsPEX1對(duì)水稻花粉育性的影響

代航，李延，劉樹春，林磊，吳娟燕，張志杰，彭崎春，李楠，張向前

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院，廣州 510642

類伸展蛋白(Leucine-Rich Repeats Extensins, LRX)是一類細(xì)胞壁嵌合蛋白，其N端包含一個(gè)LRR (leucine-rich repeats)結(jié)構(gòu)域，C端含Extensins結(jié)構(gòu)域。研究表明，LRX基因家族在擬南芥()花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)過程中具有重要作用，而水稻(L.) LRX基因家族是否在調(diào)控花粉發(fā)育方面具有保守的生物學(xué)功能尚不清楚。本研究首先進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，結(jié)果顯示，水稻LRX基因家族包括8個(gè)成員，、、位于水稻第1號(hào)染色體；和分別位于第2、第5、第6、第11和第12號(hào)染色體，其中OsPE基因在花粉中高表達(dá)，暗示可能參與了花粉發(fā)育調(diào)控。為此，本研究采用RNAi技術(shù)進(jìn)一步研究了基因?qū)ǚ郯l(fā)育的影響。結(jié)果表明，基因的RNAi轉(zhuǎn)基因植株花粉敗育，結(jié)實(shí)率僅為10%-30%。qRT-PCR分析顯示，這些RNAi轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)量顯著低于野生型，而且其表達(dá)量越低花粉育性亦隨之降低。上述研究結(jié)果表明，水稻基因是水稻花粉發(fā)育的重要基因，該基因的克隆和功能分析有助于進(jìn)一步闡明水稻花粉發(fā)育調(diào)控的分子遺傳學(xué)機(jī)制。

水稻；類伸展蛋白；花粉育性

類伸展蛋白基因家族因其編碼的蛋白含有1個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列(leucine-rich repeats, LRR)和1個(gè)伸展蛋白結(jié)構(gòu)域，該家族又稱為L(zhǎng)RX家族(leucine-rich repeats extensins)[1,2]。LRX蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中具有重要作用，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系和表達(dá)模式可以將基因分為2類：主要在營(yíng)養(yǎng)組織中表達(dá)的基因，通常用表示；主要在繁殖器官中高表達(dá)的基因，通常用()表示[3]。

LRX蛋白的功能眾多，除了促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)外，還影響營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)、形態(tài)發(fā)生、授粉受精[4,5]等，隨細(xì)胞基質(zhì)不同具有不同的功能，并表現(xiàn)出高度的組織、器官和細(xì)胞特異性[6]。通過對(duì)擬南芥()的研究，發(fā)現(xiàn)直接參與了細(xì)胞壁的形成[2]；在玉米(L.)花粉中Zmpexl蛋白也可能作為與雌蕊結(jié)合子相互作用的識(shí)別因子[1]。近來研究表明，擬南芥類伸展蛋白LRX3/4/5能夠與植物多肽類激素(rapid alkalinization factor, RALF) RALF22/23互作，而RALF與質(zhì)膜定位的受體FER互作調(diào)控鹽脅迫[7]。此外，花粉表達(dá)的ANX1/2和BUPS1/2與AtRALF4/19互作，而AtRALF4/19能與AtLRX8/9互作調(diào)控?cái)M南芥花粉管伸長(zhǎng)[8,9]。擬南芥LRX4的LRR功能域能夠與CrRLK1L (receptor-like kinase)家族成員FERONIA (FER)直接互作，表明類伸展蛋白與CrRLK1L家族成員可能存在直接聯(lián)系[10]?？紤]到CrRLK1L受體類激酶亞家族成員例如FER、ANXURs (ANX1/ANX2) 和BUDDHA'S PAPER SEAL1, 2 (BUPS1/BUPS2)可能是潛在的細(xì)胞壁感應(yīng)器[11]，這些CrRLK1L蛋白跨細(xì)胞質(zhì)膜定位能夠連接質(zhì)外體和細(xì)胞質(zhì)，在各種細(xì)胞過程有多重功能[12]。上述研究表明，類伸展蛋白可能參與了細(xì)胞壁與細(xì)胞表面信號(hào)的傳導(dǎo)過程[13]。

水稻(L.)是世界上最重要的糧食作物之一，是單子葉植物基因組研究的模式植物。目前，類伸展蛋白在水稻發(fā)育調(diào)控功能方面的研究還比較薄弱，尚無LRX類伸展蛋白調(diào)控水稻育性方面的相關(guān)報(bào)道。本研究在生物信息學(xué)分析的基礎(chǔ)上通過RNAi方法對(duì)水稻基因(LOC_Os11g43640)進(jìn)行了育性相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)水稻類伸展蛋白基因在水稻花粉發(fā)育方面具有重要的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究轉(zhuǎn)化所用的水稻材料是粳稻品種中花11，其種子來自于廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 生物信息學(xué)分析

以擬南芥中已知的LRX基因(,)序列檢索水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫MSU rice genome annotation release 7(http://rice.plantbiology.msu.edu/)，搜索水稻的同源基因，并分析水稻中LRX類基因在染色體上的位置。根據(jù)數(shù)據(jù)庫中的注釋信息，繪制水稻LRX基因家族各基因結(jié)構(gòu)圖，利用TBtools[14]繪制LRX基因的表達(dá)分析譜。

1.3 RNAi載體的構(gòu)建

按照TransZolTMUp試劑盒說明書提取水稻組織總RNA，并將檢測(cè)合格的RNA反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的水稻葉片單鏈cDNA為模板，設(shè)計(jì)并合成特異性引物(p1390-KD-PEX-F：5′-AC-GCGTGGATCCAGGAGTCACCTGAGGAACCA-3′；p1390-KD-PEX1-R：5′-CTGCAGAAGCTTATTCTT-CTGGAGTCGGTGGA-3′)，擴(kuò)增目的片段，回收之后將目的基因片段反向連接到植物表達(dá)載體pCAMBIA1390-Ubi，構(gòu)建RNAi表達(dá)載體p1390-KD- PEX1。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂板過夜培養(yǎng)后挑選單菌落進(jìn)行測(cè)序，挑選測(cè)序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105，用于遺傳轉(zhuǎn)化。

1.4 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

參照王玉珍等[15]介紹的方法，用含有目的質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液侵染中花11種子誘導(dǎo)的愈傷組織，之后對(duì)侵染的愈傷組織進(jìn)行抗性篩選以及抗性愈傷組織的分化生根，最后對(duì)幼苗進(jìn)行煉苗和移栽。

1.5 轉(zhuǎn)基因植株檢測(cè)

對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化得到的轉(zhuǎn)基因植株，按照張向前等[16]介紹的方法進(jìn)行DNA的快速提取，通過潮霉素抗性基因PCR擴(kuò)增檢測(cè)是否為轉(zhuǎn)基因陽性植株。

1.6 轉(zhuǎn)基因植株基因表達(dá)分析

水稻花粉總RNA的提取利用TransZolTMUp試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(RT-OsPEX1-F：5′- GAGATGGGCTACCTGCAGAACA-3′；RT-OsPEX1- R：5′-GTAGGCGAAGCTGAAGTTGACG-3′)，以(Actin-F：5′-GATCACTGCCTTGGCTCCTA-3′；Actin- R：5′-GTACTCAGCCTTGGCAATCC-3′)作為內(nèi)參，分析野生型和RNAi轉(zhuǎn)基因植株基因在花粉中的相對(duì)表達(dá)量。采用TaKaRa SYBR Primer Ex(Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。在冰上配制Real-time PCR反應(yīng)體系，重復(fù)3次。反應(yīng)體系如下：2×SYBR Premix Ex Taq10μL，引物F (10 μmol/L) 0.8 μL，引物R (10 μmol/L) 0.8 μL；cDNA模板10 ng，ddH2O補(bǔ)足20 μL。

1.7 轉(zhuǎn)基因植株表型觀測(cè)

收集T0代轉(zhuǎn)基因植株的種子，連續(xù)自交種植兩季之后觀測(cè)T2代表型。RNAi轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)：轉(zhuǎn)基因水稻T2代成熟后，統(tǒng)計(jì)每株各個(gè)稻穗的谷粒總數(shù)及實(shí)粒數(shù)。每穗結(jié)實(shí)率=實(shí)粒數(shù)/谷?？倲?shù)。單株結(jié)實(shí)率為每穗結(jié)實(shí)率的平均值。

花粉染色：RNAi轉(zhuǎn)基因植株和野生型抽穗后，取主穗中上部花藥長(zhǎng)度超過谷殼長(zhǎng)度2/3的成熟頂端穎花4-5朵，置于FAA (70%乙醇∶冰乙酸∶甲醛= 89∶6∶5)固定液中固定保存。碘-碘化鉀(I2-KI)溶液染色后在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。根據(jù)花粉粒的形狀、大小和著色情況將花粉分為可育花粉和敗育花粉兩種類型，可育花粉呈圓球形，積累淀粉較多，通常被I2-KI染成深藍(lán)色。而敗育花粉常表現(xiàn)出畸形，往往不含淀粉或積累淀粉較少，被I2-KI染成黃褐色。每朵穎花取3個(gè)視野，每株觀察3朵穎花，共9個(gè)視野，觀察花粉染色情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻LRX基因家族在染色體上的分布

本研究以擬南芥中已知的基因(、At1g12040)蛋白序列為模板搜索水稻的同源基因。在水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫MSU rice genome annotation release 7(http://rice.plantbiology.msu.edu/)中，共找到8個(gè)LRX類基因，分布于第1、2、5、6、11、12號(hào)染色體上，其中第1號(hào)染色體上最多，有3個(gè)成員，分別是、和；其他5條染色體上各有1個(gè)成員，分別是位于2號(hào)染色體上的，位于5號(hào)染色體上的，位于6號(hào)染色體上的，位于11號(hào)染色體上的和位于12號(hào)染色體上的(圖1)。

2.2 水稻LRX基因家族生物信息學(xué)分析

根據(jù)上述水稻基因組注釋數(shù)據(jù)庫上的注釋信息，得到水稻8個(gè)LRX類基因的′到′的序列信息。這8個(gè)基因的基因結(jié)構(gòu)如圖2所示。其中和的編碼區(qū)只包含一個(gè)外顯子，不存在內(nèi)含子序列；而基因的編碼序列包含兩個(gè)外顯子和一個(gè)內(nèi)含子。編碼蛋白質(zhì)長(zhǎng)度在455 aa~1399 aa之間，其中編碼的蛋白最長(zhǎng)(1399 aa)。

根據(jù)其表達(dá)模式(圖3)，水稻中的8個(gè)基因可以分為兩組：、、和主要在生殖器官中表達(dá)(尤其在花藥中)，在營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)量較低或者不表達(dá)；、、和在生長(zhǎng)的各個(gè)時(shí)期均有表達(dá)，其中在營(yíng)養(yǎng)器官及生殖器官中均有表達(dá)但是表達(dá)量較低。這也暗示著兩組基因可能在不同的生長(zhǎng)時(shí)期，參與水稻生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)節(jié)。

圖1 水稻類伸展蛋白基因在染色體位置示意圖

圖2 水稻類伸展蛋白基因結(jié)構(gòu)

黑色區(qū)域：外顯子；黑色線：內(nèi)含子；灰色區(qū)域：非編碼區(qū)。

2.3 水稻OsPEX1基因RNAi轉(zhuǎn)基因植株的獲得

表達(dá)譜分析表明，水稻中PEX類基因在花藥中高表達(dá)，這說明此類基因可能與花藥的形成與發(fā)育相關(guān)。為了探究PEX類基因與花藥發(fā)育的關(guān)系，本研究利用RNAi方法對(duì)基因進(jìn)行了功能研究。

本研究通過構(gòu)建基因的RNAi表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化粳稻品種中花11，獲得RNAi轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因T0代共獲得40株，用潮霉素基因特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)T0代植株(圖4)，共獲得25株轉(zhuǎn)基因陽性株。

圖3 水稻類伸展蛋白基因表達(dá)模式

2.4 水稻OsPEX1基因RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型特征

對(duì)水稻基因RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，與野生型中花11相比，所有轉(zhuǎn)基因植株的結(jié)實(shí)率顯著降低，結(jié)實(shí)率在10%~30%之間，個(gè)別植株甚至完全不育(圖5，A和B)?；虮磉_(dá)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的育性與基因的表達(dá)量呈現(xiàn)出正相關(guān)性，即的表達(dá)量越低，其對(duì)應(yīng)植株的結(jié)實(shí)率越低(圖5，B和C)。

為了進(jìn)一步闡釋影響水稻結(jié)實(shí)率的原因，本研究對(duì)轉(zhuǎn)基因T2代植株的花粉育性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)觀察。與野生型可育花粉相比，轉(zhuǎn)基因陽性植株的花粉育性顯著降低(圖6)。轉(zhuǎn)基因陽性植株的花粉形態(tài)不規(guī)則，不能被I2-KI著色，呈現(xiàn)出雄性不育特征(圖6)。綜上所述，可能在水稻花藥、花粉發(fā)育中起到了至關(guān)重要的作用，降低的表達(dá)，會(huì)影響花粉的正常發(fā)育，進(jìn)而導(dǎo)致結(jié)實(shí)率降低。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR檢測(cè)

M：DL2000 Marker；WT：野生型植株；KD：RNAi轉(zhuǎn)基因植株。

圖5 水稻野生型和OsPEX1基因RNAi轉(zhuǎn)基因植株表型及其表達(dá)分析

A：野生型和轉(zhuǎn)基因RNAi植株的主穗；B：野生型和轉(zhuǎn)基因RNAi植株的單穗結(jié)實(shí)率；C：野生型和轉(zhuǎn)基因RNAi植株中基因的相對(duì)表達(dá)量。WT：野生型植株；KD：RNAi轉(zhuǎn)基因植株。

圖6 水稻野生型和OsPEX1基因RNAi轉(zhuǎn)基因T2代植株花粉I2-KI染色

WT：野生型植株；KD：RNAi轉(zhuǎn)基因植株。

3 討論

在開花植物中，花粉發(fā)育是一個(gè)非常復(fù)雜的生物學(xué)過程[17]。小孢子母細(xì)胞在花粉囊中減數(shù)分裂產(chǎn)生小孢子，進(jìn)一步發(fā)育成花粉粒，花粉粒成熟后從花藥中釋放出來[18]。高等植物小孢子所處的花粉囊被來源于體細(xì)胞絨氈層中的糖類和脂類所填充，進(jìn)而提供了花藥早期發(fā)育所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[19]。目前，關(guān)于花粉育性基因相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究主要涉及花粉敗育和花粉缺失相關(guān)基因[20~24]。其中，花粉敗育是指，花粉受內(nèi)外環(huán)境因素影響而不能正常發(fā)育，主要原因是花粉母細(xì)胞不能正常減數(shù)分裂和絨氈層細(xì)胞異常[25]。在雄性不育系小麥S-1376中，不育系花藥絨氈層細(xì)胞提前至四分體時(shí)期降解，并在各發(fā)育時(shí)期伴隨著多糖、脂類和蛋白質(zhì)等物質(zhì)異常分布和積累，致使小孢子在由單核晚期向二核期發(fā)育的過程中物質(zhì)供應(yīng)不足，使得小孢子細(xì)胞核分裂異常，最終表現(xiàn)為花粉敗育[26]。在()突變體中，在花藥的外層不存在表皮蠟狀晶體，并且由于突變體花粉中花粉外壁形成的缺陷，小孢子的發(fā)育被嚴(yán)重阻礙并最終被破壞從而導(dǎo)致花粉敗育[27]。對(duì)于水稻花粉半不育性突變體()，由于編碼的蛋白缺失，使得花粉減數(shù)分裂減弱，花粉生活力降低，表現(xiàn)出半不育性[22]。突變體()的絨氈層不能分化和液泡化，并且小孢子母細(xì)胞不能分裂成小孢子，中間層細(xì)胞不退化，因而花粉囊不能產(chǎn)生正常花粉[28]。最新研究表明，擬南芥()突變體通過促進(jìn)細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白KRP1的降解，在花粉發(fā)育中發(fā)揮重要作用[29]。通過對(duì)一個(gè)水稻雄性不育突變體()的研究發(fā)現(xiàn)，該突變體在減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)胼胝質(zhì)沉積缺陷，而胼胝質(zhì)的異常沉積會(huì)導(dǎo)致小孢子敗育[30]。這些基因的發(fā)現(xiàn)以及功能研究，使人們對(duì)花粉育性相關(guān)的調(diào)控機(jī)制有了更深的認(rèn)識(shí)。

花粉成熟后，花藥破裂，花粉釋放，經(jīng)過風(fēng)力或昆蟲的作用落到同一朵花或另一朵花雌蕊柱頭上，引發(fā)一系列復(fù)雜的細(xì)胞形態(tài)變化和生理生化變化，其中花粉萌發(fā)、花粉管生長(zhǎng)對(duì)于雙受精的完成至關(guān)重要[31]。對(duì)擬南芥AtLRX8-11的研究表明，LRX蛋白參與了花粉管的生長(zhǎng)以及花粉管細(xì)胞壁完整性的維持。通過分析、、和這4個(gè)基因的三突變體和四突變體在花粉以及花粉管中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些LRX蛋白與花粉的萌發(fā)以及花粉管的生長(zhǎng)密切相關(guān)。突變體的花粉管細(xì)胞壁組裝受到嚴(yán)重影響，胼胝質(zhì)和果膠過度積累，導(dǎo)致花粉管異常膨大和破裂等[32~34]?；ǚ酃芗?xì)胞壁成分的變化可能與囊泡運(yùn)輸有關(guān)，而花粉管的破裂可能與Ca2+的含量有關(guān)[33]。

LRX蛋白同源比對(duì)表明，水稻類伸展蛋白有8個(gè)，第1染色體有3個(gè)，第2、5、6、11、12染色體各有1個(gè)。目前，水稻類伸展蛋白調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的機(jī)理研究還比較薄弱，尚無水稻LRX類伸展蛋白調(diào)控花粉發(fā)育的相關(guān)報(bào)導(dǎo)。植物除了具有復(fù)雜完善的膜信號(hào)系統(tǒng)，還擁有細(xì)胞壁信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使其能夠感知、傳導(dǎo)細(xì)胞壁狀態(tài)以及細(xì)胞壁組份變化，以便更好的協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)發(fā)育和提高植物適應(yīng)環(huán)境變化的能力[35]。近來研究表明，擬南芥花粉表達(dá)的LRX蛋白AtLRX8/9能夠與植物快速堿化因子AtRALF4/19互作，而AtRALF4/19進(jìn)一步通過與CrRLK1L受體類激酶互作共同調(diào)控?cái)M南芥花粉管萌發(fā)和伸長(zhǎng)[9,32~34]。這些研究表明，細(xì)胞壁LRX蛋白可能通過LRX-RALF-CrRLK1L途徑參與了植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。水稻基因組有16個(gè)CrRLK1L受體類激酶家族成員，而RALF家族成員超過40個(gè)(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。鑒于植物L(fēng)RX、CrRLK1L以及RALF蛋白家族的保守性，水稻類伸展蛋白OsPEX1應(yīng)該也有類似的分子調(diào)控模式，但有待于進(jìn)一步證明。

本研究的RNAi轉(zhuǎn)基因植株花粉敗育，結(jié)實(shí)率顯著降低，有別于目前已報(bào)道的花粉不育變異材料。水稻(LOC_Os11g43640)是1個(gè)類伸展蛋白編碼基因，不同于已克隆的花粉發(fā)育相關(guān)基因。綜上分析可知，本研究所關(guān)注的水稻基因是調(diào)控水稻花粉發(fā)育的新基因，該基因的克隆和功能分析有助于進(jìn)一步理解水稻花粉發(fā)育調(diào)控的分子遺傳學(xué)機(jī)制。

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Effect of extensin-like OsPEX1 on pollen fertility in rice

Hang Dai, Yan Li, Shunchun Liu, Lei Lin, Juanyan Wu, Zhijie Zhang, Qichun Peng, Nan Li, Xiangqian Zhang

LRXs (leucine-rich repeat extensins) are chimeric cell wall proteins containing an N-terminal leucine-rich repeat (LRR) and a C-terminal extensin domain. Increasing evidences suggest that LRXs family genes play important roles in pollen germination and pollen tube growth in. However, the functions of rice (L.) LRX genes in pollen development remain poorly understood. Bioinformatics analysis showed that the rice LRX gene family consist of eight members, namely,andlocated on chromosome 1,, O,andlocated on chromosome 2, 5, 6, 11 and 12, respectively. Thegene is preferentially expressed in rice anther, suggesting that itmay be involved in the regulation of pollen development. Next, we further investigated the role of thegene in rice by knockdown of its expression using an RNAi approach. TheRNAi transgenic lines showed a significant decrease in seed setting rate (10%~30%) due to pollen sterility. Further quantitative RT-PCR analysis indicated that thegene was significantly down-regulated in the RNAi transgenic lines. The results indicate that theplays an important role in the regulation of rice pollen development. Further studies on this gene could provide insights on the molecular and genetic mechanisms in this developmental process.

rice; leucine-rich repeats extensins; pollen fertility

2020-09-17;

2020-12-15

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：31671594)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31671594)]

代航，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：農(nóng)藝與種業(yè)。E-mail: 398035743@qq.com

張向前，博士，教授，研究方向：植物分子育種。E-mail: aacrav@163.com

10.16288/j.yczz.20-296

2021/3/2 17:09:27

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20210302.1123.001.html

(責(zé)任編委: 儲(chǔ)成才)