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(河南大學(xué)體育學(xué)院,河南開(kāi)封 475001)
骨骼肌損傷是運(yùn)動(dòng)損傷中最常發(fā)生的一種軟組織創(chuàng)傷,占運(yùn)動(dòng)損傷的40%以上[1]。在骨骼肌損傷治療的研究中,骨骼肌損傷動(dòng)物模型的可靠性、適用性和可行性與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性密切相關(guān)。下坡跑(離心運(yùn)動(dòng))骨骼肌損傷模型常常被用以研究骨骼肌運(yùn)動(dòng)性損傷[2]。在復(fù)制下坡跑(離心運(yùn)動(dòng))骨骼肌損傷模型時(shí),動(dòng)物跑臺(tái)坡度一般采用-16°,但運(yùn)動(dòng)時(shí)間及模型的取材部位等問(wèn)題還存在爭(zhēng)議。已有研究認(rèn)為,1 周連續(xù)的離心運(yùn)動(dòng)與1 次離心運(yùn)動(dòng)相比,骨骼肌損傷無(wú)積累現(xiàn)象[3],但金其貫等[4]研究則認(rèn)為短時(shí)間內(nèi)連續(xù)大強(qiáng)度的離心運(yùn)動(dòng)可造成骨骼肌損傷的累積。關(guān)于取材部位,有的研究在比目魚肌[5],有的研究在趾長(zhǎng)伸肌[6]。因此,復(fù)制下坡跑(離心運(yùn)動(dòng))骨骼肌損傷模型的方法還有待于進(jìn)一步的驗(yàn)證和考究,為骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷研究的開(kāi)展提供模型基礎(chǔ)。
本課題擬通過(guò)不同時(shí)間的大鼠離心運(yùn)動(dòng),復(fù)制大鼠骨骼肌損傷模型,通過(guò)檢測(cè)骨骼肌損傷大鼠的血清和骨骼肌的相關(guān)指標(biāo),來(lái)觀察、對(duì)比不同方法復(fù)制的大鼠骨骼肌損傷模型的特點(diǎn),為骨骼肌運(yùn)動(dòng)損傷的研究提供可靠、實(shí)用的動(dòng)物模型。
雄性Wister 大鼠24 只(SPF 級(jí),8 周齡,體重290~320 g),購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2019-0010]。大鼠飼養(yǎng)于河南大學(xué)體育學(xué)院運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)實(shí)驗(yàn)室專用動(dòng)物房?jī)?nèi)[SYXK(豫)2016-0006],大鼠分籠喂養(yǎng),每籠4 只,自然晝夜節(jié)律變化,自由進(jìn)食。室溫(23±2)℃,相對(duì)濕度40%~60%。普通飼料喂養(yǎng),飼料由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司配制。本實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)河南大學(xué)生物醫(yī)學(xué)科研倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(HUSOM -2019044),在實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的3R 原則。
乳酸脫氫酶(LDH)(批號(hào)20190617)和肌酸激酶(CK)(批號(hào)20191007)均購(gòu)自南京生物工程研究所;試劑盒RNA 提取液、QRT-PCR 引物、HE 染液均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技公司;三氯甲烷、異丙醇、無(wú)水乙醇、中性樹(shù)膠均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;D3024R 臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(DragonLab);Stepone plus 熒光定量PCR 儀(ABI)、JJ-12 J 脫水機(jī)與JB-P5 包埋機(jī)(武漢俊杰電子有限公司);RM2016病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司);Nikon Eclipse E100 正置光學(xué)顯微鏡(日本尼康)。
1.3.1 動(dòng)物分組及訓(xùn)練方法
參照文獻(xiàn)[6]方法并稍加改進(jìn)建立骨骼肌損傷模型,采用動(dòng)物跑臺(tái)運(yùn)動(dòng),下坡跑(離心運(yùn)動(dòng)),跑臺(tái)坡度-16°。雄性Wister 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后,隨機(jī)分為3 組:安靜對(duì)照組(A 組)、一次離心運(yùn)動(dòng)損傷組(1T 組)、一周離心運(yùn)動(dòng)損傷組(1 W 組),每組8 只。A 組飼養(yǎng)條件與運(yùn)動(dòng)組相同,不運(yùn)動(dòng)。1 W組先進(jìn)行1 周適應(yīng)性訓(xùn)練,再進(jìn)行1 周正式訓(xùn)練。1周適應(yīng)性訓(xùn)練方案為:第1、2 天,跑臺(tái)坡度為0°,速度為16 m/min,每天訓(xùn)練10 min;第3、4 天,跑臺(tái)坡度為-5°,速度為16 m/min,每天訓(xùn)練15 min;第5、6天,跑臺(tái)坡度為-10°,速度為16 m/min,每天訓(xùn)練30 min;第7 天休息。1 周正式訓(xùn)練方案為:第1、2 天,跑臺(tái)坡度為-16°,速度為20 m/min,每天訓(xùn)練60 min;第3~4 天,跑臺(tái)坡度為-16°,速度為20 m/min,每天訓(xùn)練90 min;第5~6 天,跑臺(tái)坡度為-16°,速度為20 m/min,每天訓(xùn)練120 min;第7 天,跑臺(tái)坡度為-16°,速度為22 m/min,訓(xùn)練120 min。1T 組訓(xùn)練方案為:第1~6 天訓(xùn)練方法同1 W 組的適應(yīng)性訓(xùn)練方案;第7 天,跑臺(tái)坡度為-16°,速度為22 m/min,訓(xùn)練120 min。
1.3.2 動(dòng)物取材和指標(biāo)檢測(cè)
最后一次訓(xùn)練結(jié)束后24 h,所有大鼠過(guò)夜禁食12 h 后,稱重,腹腔麻醉,取材。腹主動(dòng)脈采血,3000 r/min 離心20 min,取血清置于-80℃冰箱保存以備LDH、CK 檢測(cè)。取各組大鼠右下肢同一部位比目魚肌、趾長(zhǎng)伸肌置于4%多聚甲醛中固定以備HE 染色切片的制作。取各組大鼠左下肢同一部位趾長(zhǎng)伸肌、比目魚肌置于-80℃冰箱保存以備各指標(biāo)熒光定量PCR(QRT-PCR)的檢測(cè)。
1.3.3 骨骼肌HE 染色切片的制作及觀察
固定好的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌經(jīng)過(guò)脫水、浸蠟、包埋、切片4 μm;石蠟切片脫蠟至水,蘇木素染色,伊紅染色,依次脫水,中性樹(shù)膠封片;光學(xué)顯微鏡觀察,圖像采集分析。骨骼肌細(xì)胞核呈藍(lán)色、細(xì)胞質(zhì)呈紅色。
1.3.4 熒光定量PCR(QRT-PCR)檢測(cè)
分別取0.1 g 比目魚肌和0.1 g 趾長(zhǎng)伸肌,進(jìn)行總RNA 抽提,檢測(cè)RNA 純度與濃度。按Real-time qPCR 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行Real-time qPCR。采用Primer 5.0 設(shè)計(jì)目的基因,Blast 軟件檢測(cè)引物特性,Oligo 7.37 選擇最佳引物。具體引物信息如表1。PCR 擴(kuò)增:預(yù)變性(95℃,10 min),循環(huán)(40 次)(95℃,15 s→60℃,60 s),熔解曲線(60℃→95℃,每15 s 升溫0.3℃)。GAPDH 作為內(nèi)參,根據(jù)公式2-△△CT計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。
表1 各指標(biāo)qRT-PCR 引物信息Table 1 qRT-PCR primer information of each index
由表2 可知,與A 組相比,1T 組和1 W 組大鼠血清CK、LDH 水平均顯著升高(P<0.05 或P<0.01);1 W 組大鼠血清CK、LDH 水平顯著低于1T組(P<0.05 或P<0.01)。
如圖1 所示,A 組大鼠的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達(dá)水平無(wú)差異(P>0.05);1T 組大鼠的比目魚肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達(dá)水平顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.01);1T 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌TLR4 mRNA 表達(dá)水平顯著高于A 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌(P<0.01),MyD88 mRNA 表達(dá)水平顯著低于1T 組大鼠的比目魚肌(P<0.01);1 W 組大鼠的比目魚肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達(dá)水平顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.01),TLR4 mRNA 表達(dá)水平顯著低于1T組大鼠的比目魚肌(P<0.05);1 W 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌TLR4 mRNA 表達(dá)水平顯著高于A 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌(P<0.01),顯著低于1T 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌(P<0.01);1 W 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌MyD88 mRNA 表達(dá)水平顯著低于1 W 組大鼠的比目魚肌(P<0.01)。
如圖2 所示,A 組大鼠的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌的NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達(dá)均無(wú)差異(P>0.05);1T 組大鼠的比目魚肌NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達(dá)均顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.05 或P<0.01);1T 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達(dá)顯著低于1T 組大鼠的比目魚肌(P<0.01);1 W 組大鼠的比目魚肌NLRP3 mRNA 表達(dá)顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.01),1 W 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌NF-κB mRNA 表達(dá)顯著低于A 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌和1 W 組大鼠的比目魚肌(P<0.05),1 W 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌NLRP3 mRNA 表達(dá)顯著低于1 W 組大鼠的比目魚肌(P<0.01)。
如圖3 所示,A 組大鼠的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌的TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達(dá)均無(wú)差異(P>0.05);1T 組大鼠的比目魚肌TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達(dá)均顯著高于A 組大鼠的比目魚肌(P<0.05);1T 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌IL-1β mRNA 表達(dá)顯著高于A 組大鼠的趾長(zhǎng)伸肌(P<0.05)。
如圖4 所示,骨骼肌細(xì)胞HE 染色細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈紅色。各組大鼠比目魚肌中毛細(xì)血管數(shù)量多于趾長(zhǎng)伸肌。與A 組相比,1T 組大鼠的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌肌細(xì)胞間有稍許炎癥浸潤(rùn),細(xì)胞間間隙增大,但這種變化比目魚肌更明顯。與A 組相比,1T 組大鼠的比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌的顯微結(jié)構(gòu)變化不大。
研究表明[7-9],骨骼肌損傷會(huì)導(dǎo)致機(jī)體血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)活性的急劇升高。本研究結(jié)果顯示,與A 組相比,1T 組和1 W組大鼠血清CK、LDH 水平均顯著升高(P<0.05 或P<0.01);1 W 組大鼠血清CK、LDH 水平顯著低于1T 組(P<0.05 或P<0.01)。提示,與一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)相比,一周的離心運(yùn)動(dòng)雖也造成了骨骼肌細(xì)胞膜的通透性增大,骨骼肌內(nèi)CK、LDH 向外逸流增多,但對(duì)大鼠骨骼肌損傷并沒(méi)有表現(xiàn)出疊加作用。本結(jié)論與Chen 等[3]的研究結(jié)果一致,原因可能與肌肉對(duì)離心運(yùn)動(dòng)的“適應(yīng)效應(yīng)”最早可能發(fā)生在第一次離心運(yùn)動(dòng)后24 h,持續(xù)強(qiáng)化的離心訓(xùn)練對(duì)肌肉的損傷和炎癥沒(méi)有加重作用。但金其貫等[4]研究則認(rèn)為連續(xù)的離心運(yùn)動(dòng)可使骨骼肌纖維的損傷產(chǎn)生一定的累加作用。因此,關(guān)于不同離心運(yùn)動(dòng)時(shí)間對(duì)骨骼肌損傷的影響及其機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。
表2 離心運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠血清LDH、CK 水平的影響()Table 2 Effects of eccentric exercise on serum LDH and CK levels of rats in each group
表2 離心運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠血清LDH、CK 水平的影響()Table 2 Effects of eccentric exercise on serum LDH and CK levels of rats in each group
注:與安靜組A 組比較,?P<0.05,??P<0.01;與一次離心運(yùn)動(dòng)組(1T 組)比較,#P<0.05,##P<0.01。Note.Compared with Group A,?P<0.05,??P<0.01.Compared with Group(1T),#P<0.05,##P<0.01.
圖1 離心運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌TLR4 mRNA、MyD88 mRNA 表達(dá)的影響Note.The indexes of soleus muscle and extensor digitorum longus of rats in the same group were compared.The indexes of soleus muscle of rats in different groups were compared.The indexes of extensor digitorum longus between different groups were compared.Compared with soleus muscle of Group A,?P<0.05,??P<0.01.Compared with extensor digitorum longus of Group A, ΔP<0.05,ΔΔP<0.01.Compared with soleus muscle of Group(1T),#P<0.05,##P<0.01.Compared with extensor digitorum longus of Group(1T),※P<0.05,※※P<0.01.Compared with soleus muscle of Group(1 W), $P<0.05, $ $P<0.01.The same as below.Figure 1 Effects of eccentric exercise on TLR4 mRNA and MyD88 mRNA expression in soleus and extensor digitorum longus in each group
圖2 離心運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌NF-κB mRNA、NLRP3 mRNA 表達(dá)的影響Figure 2 Effects of eccentric exercise on the expression of NF -κ B mRNA and NLRP3 mRNA in soleus and extensor digitorum longus in each group
圖3 離心運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌TNF-α mRNA、IL-1β mRNA 表達(dá)的影響Figure 3 Effects of eccentric exercise on the expression of TNF-α mRNA and IL-1β mRNA in soleus and extensor digitorum longus in each group
圖4 離心運(yùn)動(dòng)對(duì)各組大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌顯微結(jié)構(gòu)的影響Figure 4 Effects of eccentric exercise on the microstructure of soleus muscle and extensor digitorum longus in each group
Toll 樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)是Toll樣受體家族的重要成員之一,TLR4 及其信號(hào)通路可激活機(jī)體固有免疫系統(tǒng)。TLR4/MyD88(myeloid differentiation factor-88)是TLR4 的主要信號(hào)通路?;就緩饺缦耓10-13]:TLR4 被激活后,首先形成LPS/TLR4/MD2 復(fù)合物,然后招募接頭蛋白MyD88,從而進(jìn)一步激活NF-κB(nuclear factor-κB,NF-κB),刺激炎癥細(xì)胞合成和釋放 IL-1β(interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等前炎性因子的表達(dá),進(jìn)一步引起機(jī)體的炎癥反應(yīng)和組織損傷。
Nod 樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3,NLRP3)也是機(jī)體固有免疫系統(tǒng)的識(shí)別受體,是一種重要的炎癥調(diào)節(jié)因子。TLR4 屬于膜表面受體,NLRP3 是胞質(zhì)內(nèi)受體。TLR4/MyD88 信號(hào)通路激活NF-κB 后,介導(dǎo)無(wú)活性IL-1β 前體(pro-IL-1β)的產(chǎn)生,NLRP3 活化可將pro-IL-1β 剪切為活化的IL-1β,從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)[14]。同時(shí)也有研究證明,NF-κB信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)NLRP3 炎癥小體活化的作用[15]。由此可見(jiàn),NLRP3 與TLR4/MyD88/NF-κB 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)之間存在反饋調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),它們相互協(xié)作,共同發(fā)揮作用。
本研究結(jié)果表明,一次離心運(yùn)動(dòng)和一周離心運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌均造成了一定程度的損傷與炎癥。相對(duì)于一周離心運(yùn)動(dòng)來(lái)說(shuō),一次大強(qiáng)度離心運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠骨骼肌造成的損傷更嚴(yán)重,炎癥因子的表達(dá)水平更高,且大鼠比目魚肌的損傷程度比趾長(zhǎng)伸肌更大。一次離心運(yùn)動(dòng)組(1T)比目魚肌TLR4、MyD88、NF-κB、NLRP3、TNF-α、IL-1β 基因表達(dá)均顯著上升,而且比目魚肌相關(guān)炎癥因子的表達(dá)顯著高于趾長(zhǎng)伸肌。研究表明,骨骼肌炎癥與TLR4/MyD88 信號(hào)通路激活有密切關(guān)系。Kwon 等[16]將小鼠后肢去負(fù)荷14 d,野生型(WT)小鼠的骨骼肌表現(xiàn)為葡萄糖攝取受損、肌肉胰島素信號(hào)異常,同時(shí)骨骼肌TLR4、NF-κB、炎癥因子表達(dá)上升,而MyD88(-/-)小鼠卻沒(méi)表現(xiàn)出此現(xiàn)象。離心運(yùn)動(dòng)會(huì)引起人體骨骼肌相關(guān)炎性因子表達(dá)的變化[17-19],這可能與離心運(yùn)動(dòng)可激活機(jī)體TLR4/MyD88 信號(hào)通路相關(guān)。研究表明[20-21],急性的離心運(yùn)動(dòng)會(huì)激活男、女外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)TLR4/MyD88 信號(hào)通路,引起NF-κB、IL-1、TNF-α 的表達(dá)增多。過(guò)度的離心運(yùn)動(dòng)也會(huì)導(dǎo)致短暫的下丘腦炎癥,可導(dǎo)致過(guò)度運(yùn)動(dòng)小鼠的體重和攝食的減少[22]。老年人髖部骨折引起的股四頭肌炎癥同樣與TLR4/MyD88 信號(hào)通路的激活有關(guān),3 個(gè)月的運(yùn)動(dòng)康復(fù)訓(xùn)練,能夠降低TLR4/MyD88 信號(hào)通路的活性,降低與骨骼肌炎癥相關(guān)的基因表達(dá)[23]。同樣,離心運(yùn)動(dòng)會(huì)導(dǎo)致大鼠骨骼肌中TLR4、MyD88 表達(dá)增多,NF-κB、TNF-α、IL-1β 等炎性因子的表達(dá)上升,抗炎藥的使用可以改善離心運(yùn)動(dòng)大鼠骨骼肌的炎癥狀態(tài)[24]。因此,本研究所采用的離心運(yùn)動(dòng)方式造成的大鼠骨骼肌的損傷和炎癥,可能與TLR4/MyD88 信號(hào)通路的激活密切相關(guān),至于同樣的離心運(yùn)動(dòng)方式,卻對(duì)大鼠比目魚肌和趾長(zhǎng)伸肌的損傷和炎癥因子表達(dá)的影響不同,具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。