徐曉申郭 萌楊 青

(鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院超聲診斷科,鄭州 450000)

肝硬化由多種病因長(zhǎng)時(shí)間作用最終導(dǎo)致彌漫性肝損害的一種慢性進(jìn)行性疾病,是多種肝疾病發(fā)展晚期的不可逆階段[1]。肝硬化早期主要表現(xiàn)為乏力、腹脹、嘔吐等癥狀,后期表現(xiàn)為肝功能損害及門脈高壓,組織病理學(xué)上表現(xiàn)為肝細(xì)胞壞死、殘存肝細(xì)胞再生以及結(jié)締組織增生、纖維隔形成,使肝小葉正常結(jié)構(gòu)遭到破壞形成假小葉,繼而肝變形、變硬,發(fā)展為肝硬化[2-3]。心肌損害及頸部血管病變是肝硬化重要并發(fā)癥之一,心肌損害引起心室代償性反應(yīng),發(fā)生心室重構(gòu),影響心肌收縮和舒張功能[4-5],并引起外周血管功能及血流動(dòng)力學(xué)改變[6],嚴(yán)重者可導(dǎo)致心功能減退。由于心肌活檢創(chuàng)傷性較大,故選擇靈敏準(zhǔn)確的手段及時(shí)評(píng)估肝硬化對(duì)心肌造成的損傷,對(duì)疾病的臨床預(yù)后有重要意義。超聲診斷具有非侵入性、成像快、準(zhǔn)確率高等優(yōu)點(diǎn),臨床通過超聲診斷肝硬化可以提供清晰圖像和血流動(dòng)力學(xué)變化,故本研究通過建立肝硬化大鼠模型,采用高頻超聲評(píng)估心臟功能及頸部血管改變,了解肝硬化與心肌損害及頸部血管病變的關(guān)系,旨在為臨床準(zhǔn)確快速評(píng)估肝硬化對(duì)心肌及頸部血管造成的損害提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠40 只,7 周齡,體重200～210 g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006],在鄭州大學(xué)(藥物研究院)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)[SYXK(豫)2018-0005],保持溫度23℃～25℃,相對(duì)濕度55%～65%,12 h/12 h 明暗周期循環(huán),購(gòu)入后適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過(2018060319),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合3R 原則。

1.2 主要試劑與儀器

四氯化碳(CCl4),德州潤(rùn)昕實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,批號(hào):20 150107;苯巴比妥那注射液,天津金耀藥業(yè)有限公司,批號(hào):20 180306;Vivid7 全數(shù)字彩色多普勒超聲診斷儀,美國(guó)GE 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 建模及分組

隨機(jī)選取25 只大鼠誘導(dǎo)肝硬化模型[7]:用橄欖油將CCl4稀釋成終濃度40%、50%的橄欖油CCl4溶液備用,用蒸餾水將苯巴比妥注射液稀釋成0.35 g/L 濃度備用。實(shí)驗(yàn)開始后,大鼠飼喂正常飼料,給予苯巴比妥溶液飲水,連續(xù)1 周;第2～5 周,飲水改為10%乙醇溶液,同時(shí)按5 mL/kg 體重腹腔注射40%橄欖油CCl4溶液,2 次/周;第6 周開始,飲水改為30%乙醇溶液,同時(shí)按5 mL/kg 體重腹腔注射50%橄欖油CCl4溶液,2 次/周,連續(xù)4 周。剩余15只為對(duì)照組,給予正常進(jìn)食飲水,從實(shí)驗(yàn)開始,按5 mL/kg 體重腹腔注射生理鹽水,2 次/周,至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程觀察所有大鼠進(jìn)食飲水及日常活動(dòng)等一般情況。實(shí)驗(yàn)過程中剔除模型組死亡大鼠6 只,以肝組織切片觀察到假小葉形成視為建模成功[8],后續(xù)HE 染色剔除無(wú)假小葉形成的3 只大鼠實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),本研究模型組建模成功大鼠共16 只。

1.3.2 檢查心臟

大鼠麻醉后仰臥位固定于木板上,并向左側(cè)傾斜30°,胸前備皮,連接導(dǎo)聯(lián)心電圖,對(duì)心臟進(jìn)行掃查,檢測(cè)頻率為11.4 MHz,多普勒檢測(cè)頻率為6.0 MHz,圖像深度調(diào)至2 cm。探頭置于左側(cè)胸骨上,顯示左胸骨旁左心室長(zhǎng)軸切面、左心室短軸切面,二維心動(dòng)超聲圖像引導(dǎo)行M 型進(jìn)行測(cè)量,連續(xù)測(cè)量5個(gè)心動(dòng)周期,取平均值。

測(cè)量指標(biāo):①左心室舒張期末內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVEDD)、左心室收縮期末內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVESD);②左心室前壁舒張末期厚度(left ventricular anterior wall end-diastolic thickness,LVAWT)、左心室后壁收縮末期厚度(left ventricular posterior wall end diastolic thickness,LVPWT);③左心室長(zhǎng)軸切面通過單平面面積-長(zhǎng)度法測(cè)量左心室舒張末期容積(left ventricular end diastolic volume,LVEDV)、收縮末期容積(left ventricular end systolic volume,LVESV);④心率(heart rate,HR);⑤左心室重量(left ventricular mass,LVM),LVM=1.05 ×[(LVEDD+LVAWT+LVPWT)3—LVEDD3];⑥左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF),LVEF=(LVEDV—LVESV)/LVEDV×100%;⑦左心室軸縮短率(fraction shortening,FS),FS=(LVEDD—LVESD)/LVEDD×100%。

1.3.3 檢查頸部血管

對(duì)雙側(cè)頸部皮膚備皮后進(jìn)行超聲掃查,檢測(cè)頸總動(dòng)脈管壁隨心動(dòng)周期的運(yùn)動(dòng)軌跡,測(cè)量血管內(nèi)徑、管壁厚度、血流速度、脈動(dòng)指數(shù)(pulsation index,PI)、阻力指數(shù)(resistance index,RI),結(jié)果取雙側(cè)平均值。

1.3.4 左心室稱重及病理學(xué)檢查

高頻超聲檢查完畢后,處死大鼠,摘取心臟,分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈及左肝,頸總動(dòng)脈置于4%多聚甲醛中固定,肉眼觀察肝大體病變情況,之后置于多聚甲醛進(jìn)行固定。取心臟沿房室溝和室間溝處,切除左心房及右心室,保留室間隔,用過濾紙擦干表面血跡,對(duì)左心室進(jìn)行稱重。

稱重后,對(duì)左心室、雙側(cè)頸總動(dòng)脈損傷處、左肝進(jìn)行包埋、切片,行常規(guī)HE 染色,置于顯微鏡下觀察各組織病理形態(tài)學(xué)變化,測(cè)量頸總動(dòng)脈切片內(nèi)膜厚度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,兩樣本比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)法計(jì)算超聲測(cè)量LVM 與實(shí)測(cè)LVM 及超聲頸總動(dòng)脈管壁厚度與HE 染色頸總動(dòng)脈內(nèi)膜厚度測(cè)量值的相關(guān)系數(shù)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況及LVM 比較

對(duì)照組大鼠皮光毛亮,觸之手感順滑,反應(yīng)靈敏,進(jìn)食飲水及日?；顒?dòng)正常;模型組大鼠皮毛雜亂無(wú)光,脫毛,精神萎靡不振,拒食拒水,嗜睡,活動(dòng)量減少。

對(duì)照組、模型組實(shí)測(cè)LVM 分別為:(723.68±79.49)mg、(867.45±85.21)mg,2 組實(shí)測(cè)LVM 比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.849,P=0.000)。

2.2 肝病理形態(tài)學(xué)

肉眼觀察:對(duì)照組肝顏色紅潤(rùn),表面光滑,質(zhì)地柔軟;模型組肝顏色呈棕黃色,表面粗糙不平,質(zhì)地較硬,體積減小,表面分布有大小不一的增生結(jié)節(jié),可見黃色顆粒。

鏡檢:對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常,中央靜脈周圍肝細(xì)胞呈放射狀,排列整齊規(guī)則。模型組正常肝小葉結(jié)構(gòu)消失,出現(xiàn)假小葉,肝細(xì)胞排列紊亂,中央靜脈消失或偏向邊緣,肝細(xì)胞有不同程度的變性及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。見圖1。

2.3 心肌及頸總動(dòng)脈病理形態(tài)學(xué)

對(duì)照組心肌纖維結(jié)構(gòu)清晰,排列整齊,肌纖維走向規(guī)律;模型組心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散、腫脹,排列紊亂,肌纖維走向混亂,出現(xiàn)斷裂及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),細(xì)胞外間質(zhì)增多。對(duì)照組頸總動(dòng)脈層次清晰、結(jié)構(gòu)完整,血管壁厚度均勻;模型組頸總動(dòng)脈血管內(nèi)壁有不同程度增厚,管腔變窄,管腔面積變小,層次不清,結(jié)構(gòu)混亂。見圖2、圖3。

對(duì)照組和模型組頸總動(dòng)脈組HE 染色內(nèi)膜厚度的測(cè)量值分別為:(13.01±0.45)μm,(60.34±0.58)μm,模型組HE 染色內(nèi)膜厚度的測(cè)量值大于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=252.621,P=0.000)。

2.4 心臟超聲測(cè)值比較

模型組大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV、LVM、HR高于對(duì)照組,FS 低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),兩組大鼠LVAWT、LVPWT、LVESV、LVEF比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、圖4。

圖1 肝病理形態(tài)學(xué)觀察Figure 1 Observation of pathological morphology of liver

圖2 心肌病理形態(tài)學(xué)觀察Figure 2 Observation of pathological morphology of myocardium

表1 心臟高頻超聲測(cè)值比較()Table 1 Comparison of cardiac high-frequency ultrasound measurements

表1 心臟高頻超聲測(cè)值比較()Table 1 Comparison of cardiac high-frequency ultrasound measurements

注:與對(duì)照組比較,?P<0.05。Note.Compared with the control group,?P<0.05.

2.5 頸總動(dòng)脈超聲測(cè)值比較

模型組大鼠血管內(nèi)徑、血流速度小于對(duì)照組,管壁厚度、PI、RI 大于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2、圖5。

2.6 心臟及頸總動(dòng)脈超聲數(shù)值與測(cè)量數(shù)值相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析,超聲LVM 與實(shí)測(cè)LVM呈正相關(guān)(r=0.875,P<0.001);超聲頸總動(dòng)脈管壁厚度與HE 染色頸總動(dòng)脈內(nèi)膜厚度的測(cè)量值呈正相關(guān)(r=0.821,P<0.001)。

3 討論

圖3 頸總動(dòng)脈組織形態(tài)學(xué)觀察Note.A1,Control group .A2,Control group .B1,Model group .B2,Model group .Figure 3 Observation of histomorphology of common carotid artery

表2 頸總動(dòng)脈超聲測(cè)值比較()Table 2 Comparison of ultrasound measurements of common carotid artery

表2 頸總動(dòng)脈超聲測(cè)值比較()Table 2 Comparison of ultrasound measurements of common carotid artery

注:與對(duì)照組比較,?P<0.05。Note.Compared with the control group,?P<0.05.

圖4 心功能超聲檢測(cè)Figure 4 Heart function ultrasound

圖5 頸總動(dòng)脈超聲圖Figure 5 Carotid ultrasound

肝硬化是肝實(shí)質(zhì)病變的終末結(jié)果,隨著肝纖維化不斷發(fā)展,可導(dǎo)致多器官并發(fā)癥,累及消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng),晚期繼發(fā)感染,出現(xiàn)腹水、癌變等并發(fā)癥,嚴(yán)重危害人類健康,對(duì)于肝硬化患者應(yīng)當(dāng)早發(fā)現(xiàn)早治療,阻止疾病進(jìn)展,從而減少并發(fā)癥[9-10]。肝硬化患者心功能存在異?，F(xiàn)象,長(zhǎng)期高動(dòng)力循環(huán),使心室負(fù)荷加重,造成鈉水潴留,從而引起心肌相對(duì)供血不足,最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大以及心肌間質(zhì)纖維化,即心室重構(gòu),包括心室厚度、容積及結(jié)構(gòu)等方面的改變[11-12]。本研究通過建立肝硬化大鼠模型,模擬心臟損傷,研究肝硬化心肌損傷過程,以期為改善心功能狀態(tài),降低肝硬化心臟并發(fā)癥發(fā)生率提供參考。

本研究鏡檢模型組肝正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,出現(xiàn)假小葉,門靜脈消失或偏向邊緣,成功建立肝硬化大鼠模型。肝硬化患者心肌功能減退,出現(xiàn)心室重構(gòu),通過超聲觀察心臟結(jié)構(gòu)和功能改變是一種理想的無(wú)創(chuàng)檢查方式,隨著超聲技術(shù)的發(fā)展及高頻探頭的應(yīng)用,圖像清晰度和分辨率在一定程度上得到提高[13]。近年來(lái),研究者通過不斷改進(jìn)方法方式,運(yùn)用高頻超聲在觀察大鼠心臟方面獲得長(zhǎng)足進(jìn)步,為研究心血管系統(tǒng)疾病奠定了基礎(chǔ)。本研究運(yùn)用高頻超聲檢測(cè)大鼠心臟功能,可觀察到清晰左心室長(zhǎng)軸切面及左心室短軸切面,模型組大鼠模型組大鼠LVEDD、LVESD、LVEDV、LVM、HR 顯著高于對(duì)照組,FS 低于對(duì)照組,提示模型組大鼠左心室心腔增大,心室肥厚,發(fā)生重構(gòu),與臨床患者超聲結(jié)果一致[14]。肝硬化患者尸檢結(jié)果顯示,肝硬化伴有心臟損害,包括心室擴(kuò)張或肥厚,心肌纖維結(jié)構(gòu)改變、心肌間質(zhì)水腫或出等結(jié)構(gòu)和功能改變[15]。本研究HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠心肌纖維走向混亂,心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)松散,排列紊亂,出現(xiàn)斷裂、腫脹及炎性浸潤(rùn),細(xì)胞外間質(zhì)增多,提示肝硬化發(fā)生后伴有明顯心肌損傷,與患者尸檢結(jié)果一致,表明該模型可在一定程度模擬肝硬化患者心肌損傷過程。肝硬化可累及心肌損傷,導(dǎo)致一系列心功能障礙,本研究中高頻超聲結(jié)果與病理學(xué)變化一致,組織病理學(xué)心肌纖維形態(tài)改變心功能改變的病理基礎(chǔ),表明運(yùn)用高頻超聲可用于檢測(cè)大鼠肝硬化引起的心肌損傷。

肝硬化患者循環(huán)系統(tǒng)呈高血流動(dòng)力狀態(tài),引起血管肥厚、血管內(nèi)皮受損,RI 升高,血流速度變慢,導(dǎo)致血管彈性降低,對(duì)患者頸總動(dòng)脈進(jìn)行超聲檢測(cè),顯示回聲增強(qiáng),內(nèi)膜增厚,管腔變窄,嚴(yán)重者可引起動(dòng)脈粥樣硬化[16-17]。本研究通過超聲對(duì)大鼠頸總動(dòng)脈進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示模型組血管內(nèi)徑變窄、血流速度變慢,PI 及RI 升高,提示肝硬化大鼠伴有頸總動(dòng)脈結(jié)構(gòu)及功能改變,與臨床患者超聲結(jié)果一致[18];HE 染色顯示頸總動(dòng)脈管腔血管內(nèi)壁有不同程度增厚,管腔變窄,管腔面積變小,且結(jié)構(gòu)混亂層次不清,與超聲結(jié)果相符,提示高頻超聲可用于檢測(cè)肝硬化大鼠頸總動(dòng)脈形態(tài)和功能的改變。頸總動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)改變與心室重構(gòu)密切相關(guān),頸動(dòng)脈管腔和厚度隨左心室改變而發(fā)生變化[19]。患者發(fā)生左心室肥厚,引起頸總動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度增加,管腔變窄,血流變慢[20]。本研究高頻超聲結(jié)果顯示,肝硬化伴有頸總動(dòng)脈血管結(jié)構(gòu)和功能改變,表明運(yùn)用高頻超聲可用于檢測(cè)肝硬化頸總動(dòng)脈的改變。

本研究經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析,超聲LVM 與實(shí)稱LVM 呈正相關(guān),提示超聲檢測(cè)與實(shí)際檢測(cè)具有相關(guān)性,通過高頻超聲檢測(cè)肝硬化大鼠心臟及頸總動(dòng)脈形態(tài)功能的改變,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,值得臨床推廣,為進(jìn)一步研究肝硬化發(fā)病機(jī)制,及早改善心功能狀態(tài)提供理論參考。