白 蕓 李永臻 祁艷娟 龍啟福?

(1.青海省人民醫(yī)院藥學(xué)部,西寧 810000;2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究中心,西寧 810016;3.青海大學(xué)附屬醫(yī)院放射治療科,西寧 810000)

肝癌是由肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞發(fā)生的惡性腫瘤[1]。目前,臨床上肝癌的治療存在預(yù)后差、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等因素使得近5 年肝癌患者的生存率仍然低于20%[2-3]。鑒于此,不同治療方式的協(xié)同治療將成為降低肝癌死亡率的重要舉措之一。近年來(lái),中醫(yī)藥療法在惡性腫瘤的治療過(guò)程中被廣泛應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn),中醫(yī)藥在減少肝癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、提高患者存活率方面發(fā)揮了一定的積極作用[4]。

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)通過(guò)干擾核酸的合成來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞增殖,是具有細(xì)胞周期特異性的細(xì)胞毒類(lèi)抗癌藥物[5],臨床使用非常廣泛,但是隨著化療進(jìn)行,出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用,例如胃腸道反應(yīng),骨髓抑制等[6]。大量研究表明[1,7-8],5-FU單獨(dú)用藥正在被與其它藥物的聯(lián)合作用所取代,這不僅可以降低藥物的副作用,而且還能降低腫瘤對(duì)藥物的耐藥性,相比于單獨(dú)用藥,聯(lián)合用藥具有更加廣闊的應(yīng)用前景。黃芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥黃芪的主要活性成分之一,具有增強(qiáng)免疫,抗應(yīng)激,抗炎,抗氧化等藥理作用[9],可協(xié)同增強(qiáng)多種化療藥物對(duì)腫瘤的治療效果[10-11]。研究表明,上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions,EMT)指機(jī)體細(xì)胞由上皮表型向間質(zhì)表型的轉(zhuǎn)變,其與腫瘤的發(fā)生、原位侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[12]。因此,本研究擬就黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2 EMT 的影響進(jìn)行研究,以期為黃芪多糖和5-FU 在臨床的聯(lián)合應(yīng)用提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株

人肝癌HepG2 細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑與儀器

5-氟尿嘧啶購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司(批號(hào):1803091);黃芪多糖凍干粉(純度96.81%)購(gòu)自天津賽諾制藥有限公司(批號(hào):Z20040086);胎牛血清(FBS)和青/鏈霉素購(gòu)自HyClone 公司;MTT 粉劑、DMSO、DMEM 高糖細(xì)胞培養(yǎng)液、5×蛋白上樣緩沖液、BCA 蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司;RIPA 裂解液、SDS-PAGE 凝膠試劑盒購(gòu)自Beyotime公司;Transwell 小室、PVDF 膜、ECL 發(fā)光液購(gòu)自Miliipore 公司;鼠抗人CXCR4 單克隆抗體、兔抗Ecadherin、vimentin 單克隆抗體、羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記(HRP)的二抗均購(gòu)自Abcam 公司;兔抗GAPDH 購(gòu)自上?？党缮锕こ逃邢薰?Total RNA 提取試劑(RNAiso Plus)、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購(gòu)自TaKaRa 公司;熒光定量PCR 試劑盒[HieefTMqPCR SYBR Green Master Mix(Low Rox Plus)]購(gòu)自翊圣生物公司;實(shí)驗(yàn)所用引物由日本TaKaRa 公司合成。

二氧化碳培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司(型號(hào):HERAcell 150i、DW-HL528、StepOne Plus);倒置顯微鏡購(gòu)自O(shè)lympus 公司(型號(hào):MF53);酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio Rad 公司(型號(hào):iMark);電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自北京六一生物科技公司(型號(hào):DYCZ-25D、DYCZ-40G);水浴鍋購(gòu)自上海況勝有限公司(型號(hào):HH-S1);高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf 公司(型號(hào):5424R);搖床購(gòu)自美國(guó)Scilogex 公司(型號(hào):SKO180-E);化學(xué)發(fā)光成像儀購(gòu)自北京賽智科技有限公司(型號(hào):MiniChemi 610)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境為DMEM 高糖培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和1%青/鏈霉素),細(xì)胞于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況,當(dāng)細(xì)胞數(shù)量占培養(yǎng)瓶底部70%～80%時(shí)用0.25%的胰酶消化傳代,常規(guī)每2～3 d 1 次。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組

本研究旨在探討黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞EMT 的影響,根據(jù)研究目的可分為五個(gè)實(shí)驗(yàn)組,詳見(jiàn)表1。

1.3.3 MTT 測(cè)定藥物對(duì)HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種至96 孔板(100 μL 細(xì)胞懸液/孔,約2×104個(gè)細(xì)胞),于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后棄去原培養(yǎng)基,并用PBS 緩沖液清洗2 遍。在各孔中加入不同濃度藥物并做好標(biāo)記,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔于原培養(yǎng)環(huán)境下繼續(xù)培養(yǎng)。分別于24 h、48 h 時(shí)加入20 μL 12.07 mmol/L 的MTT 溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄盡上清液,每孔加入150 μL DMSO 溶液,37℃避光孵育10 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔細(xì)胞的吸光度OD 值,波長(zhǎng)為490 nm,計(jì)算藥物對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(1-處理組OD 均值/空白組OD均值)×100%。

1.3.4 Transwell 檢測(cè)HepG2 細(xì)胞侵襲能力

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種到6 孔板(100 μL 細(xì)胞懸液/孔,約2×104個(gè)細(xì)胞),常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后在相應(yīng)孔中加入所需藥物,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。24 h 后,將Matrigel 溶液加入到Transwell 小室以覆蓋聚碳酸酯膜,37℃干燥30 min。在Transwell 小室下層加入培養(yǎng)基(含10%FBS)作為趨化因子,小室上層孔中加入含1×105個(gè)細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)24 h 后用棉簽拭去未遷移細(xì)胞,無(wú)水乙醇固定20 min,結(jié)晶紫染色30 min,PBS 緩沖液沖洗2 次。高倍顯微鏡下統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)HepG2 細(xì)胞EMT 相關(guān)基因的表達(dá)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種至12 孔板,常規(guī)培養(yǎng),待貼壁細(xì)胞數(shù)量占培養(yǎng)瓶底部90%時(shí)按分組給藥,每組設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h 后棄去培養(yǎng)基,收集細(xì)胞,按照RNAiso Plus(TRIzol)試劑說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總RNA,并利用分光光度儀測(cè)定樣品純度和濃度。以1 μg RNA 為模板,按照cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照熒光定量PCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞中E-cadherin、vimentin mRNA、CXCR4 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見(jiàn)表2。

1.3.6 Western blot 檢測(cè)HepG2 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白的表達(dá)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后接種至12 孔板,常規(guī)培養(yǎng),待貼壁細(xì)胞數(shù)量占培養(yǎng)瓶底部90%時(shí)按分組給藥。常規(guī)培養(yǎng)24 h 后棄去上清,收集細(xì)胞,用RIPA 裂解液(含1 mmol/L PMSF)提取總蛋白,采用BCA 蛋白定量法測(cè)定所提蛋白的濃度。向待測(cè)樣品中加入5×上樣緩沖液煮沸10 min。上樣,10% SDS-PAGE 電泳分離蛋白,400 mA 轉(zhuǎn)膜1.5 h。轉(zhuǎn)膜后將PVDF 膜置于5%脫脂牛奶中,室溫封閉1.5 h,按1 ∶1000 封閉液中加入E-cadherin、vimentin、CXCR4、GAPDH(內(nèi)參)一抗于4℃孵育過(guò)夜,TBST 洗滌后加入二抗(1 ∶5000),并于室溫孵育1.5 h。ECL 試劑盒顯色,化學(xué)發(fā)光成像儀上顯影并采集圖片,用Image pro plus 軟件分析E-cadherin、vimentin、CXCR4 蛋白表達(dá)量。

表1 實(shí)驗(yàn)的分組信息Table 1 Grouping information for the experiment

表2 EMT 相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 引物序列Table 2 Real time PCR primer sequence of EMT related genes

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,數(shù)據(jù)資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,多組間的比較采用方差分析,組間兩兩比較采用LSD 法,P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并用軟件Origin 9.0 對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果

2.1 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)

給藥后24 h,A 組(空白組)HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率為0,B 組(5-FU 組),C 組(黃芪多糖組),D組(392.63 μmol/L 黃芪多糖+23.90 μmol/L 5-FU)及E 組(785.26 μmol/L 黃芪多糖+23.90 μmol/L 5-FU)的生長(zhǎng)抑制率分別是(11.56±2.18)%,(21.32±1.59)%,(39.75±1.85)%,(57.19 ±2.02)%,抑制率逐漸增高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見(jiàn)表3;給藥48 h 后,從A 組到E 組的抑制率分別是:0%,(18.54 ± 2.13)%,(30.28 ± 1.8)%,(45.82 ±1.46)%,(63.97±1.75)%,抑制率逐漸增高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,詳見(jiàn)表3。從以上數(shù)據(jù)可以得出,與空白組相比,其余各組作用于HepG2 細(xì)胞時(shí),對(duì)其生長(zhǎng)均有抑制作用,且隨著藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制效應(yīng)增強(qiáng);黃芪多糖或5-FU 單獨(dú)處理組與聯(lián)合用藥組相比較,聯(lián)合用藥組的抑制效應(yīng)顯著強(qiáng)于單獨(dú)處理組,且隨著黃芪多糖濃度的增加抑制作用增強(qiáng)。

2.2 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1),HepG2 細(xì)胞經(jīng)結(jié)晶紫染色后呈現(xiàn)紫色,形狀為不規(guī)則梭型,從A組(空白組)到E 組(785.26 μmol/L 黃芪多糖+23.90 μmol/L 5-FU),穿膜細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少,說(shuō)明細(xì)胞侵襲能力下降,具體穿膜數(shù)量詳見(jiàn)表4。與空白組相比,5-FU 組、黃芪多糖組及黃芪多糖聯(lián)合5-FU 組HepG2 細(xì)胞的侵襲能力顯著下降(P≤0.01);與5-FU 組相比較,黃芪多糖聯(lián)合5-FU 組HepG2 細(xì)胞的侵襲能力顯著下降(P≤0.01),且隨著黃芪多糖劑量的增加,侵襲能力逐漸下降。

表3 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用()Table 3 Inhibitory effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on proliferation of HepG2 cells

表3 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的抑制作用()Table 3 Inhibitory effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on proliferation of HepG2 cells

注:與A 組相比較,?P≤0.05,??P≤0.01;與B 組相比,▲▲P≤0.01。Note.Compared with group A,?P ≤0.05,??P ≤0.01.Compared with group B,▲▲P ≤0.01.

表4 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞侵襲力的影響()Table 4 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the invasiveness of HepG2 cells

表4 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞侵襲力的影響()Table 4 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the invasiveness of HepG2 cells

2.3 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞EMT 相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響

由圖2 可知,與空白對(duì)照組相比,黃芪多糖組、5-FU 組和黃芪多糖聯(lián)合5-FU 組HepG2 細(xì)胞E-cadherin mRNA 表達(dá)量增加、vimentin mRNA 和CXCR4 mRNA表達(dá)量下降,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05;P≤0.01);與5-FU 組相比較,聯(lián)合作用組HepG2 細(xì)胞Ecadherin mRNA 表達(dá)量均增加、vimentin mRNA 和CXCR4 mRNA 表達(dá)量均下降(P≤0.05;P≤0.01)。

2.4 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

由圖3 和表5 可知,與空白對(duì)照組相比,黃芪多糖組、5-FU 組和黃芪多糖聯(lián)合5-FU 組HepG2 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)量上調(diào)、vimentin 蛋白、CXCR4 蛋白表達(dá)量下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.01);與5-FU 組相比較,聯(lián)合組HepG2 細(xì)胞E-cadherin 蛋白表達(dá)量均增加、vimentin 蛋白和CXCR4 蛋白表達(dá)量均下降,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P≤0.05;P≤0.01)。

圖1 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞侵襲力的影響Note.Compared with group A,??P ≤0.01.Compared with group B,##P ≤0.01.Figure 1 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the invasiveness of HepG2 cells

表5 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Table 5 Effect of astragalus polysaccharide combined with 5-FU on the expression of EMT-related proteins in HepG2 cells

圖2 黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞EMT 相關(guān)基因mRNA 表達(dá)的影響Note.Compared with group A,?P <0.05,??P <0.01.Compared with group B,#P <0.05,##P <0.01.Figure 2 Effect of Astragalus polysaccharide combined with 5-FU on mRNA expression of EMT-related genes in HepG2 cells

3 討論

肝癌治療難度大,預(yù)后差,一直是臨床上面臨的重大難題和挑戰(zhàn),其主要因素是肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,而EMT 是癌細(xì)胞獲取遷移和侵襲能力的重要機(jī)制[12]。臨床上對(duì)癌癥患者進(jìn)行放化療治療時(shí),會(huì)不同程度的影響其免疫系統(tǒng),且隨著腫瘤耐藥及藥物敏感性降低等情況的出現(xiàn),臨床上常出現(xiàn)治療失敗的情況,因此采用中藥及其活性成分與化療藥物聯(lián)合使用,以達(dá)到調(diào)節(jié)免疫力進(jìn)而增敏增效和減毒的作用。黃芪多糖是黃芪中最重要的天然活性成分,毒性較小,可以具有抗腫瘤的作用[13]。因此,在本研究中,我們采用HepG2 細(xì)胞體外培養(yǎng)的方法,研究了黃芪多糖聯(lián)合5-FU 對(duì)HepG2 細(xì)胞EMT 轉(zhuǎn)化影響,研究結(jié)果顯示黃芪多糖和5-FU 聯(lián)用時(shí),可明顯抑制HepG2 細(xì)胞的生長(zhǎng),抑制效應(yīng)具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖和5-FU 聯(lián)用可以顯著降低肝癌細(xì)胞的侵襲能力,且隨著黃芪多糖濃度的增加侵襲能力越弱。

中藥黃芪的藥用歷史在我國(guó)已經(jīng)有兩千多年,是中醫(yī)補(bǔ)氣的常用藥,主要藥效成分黃芪多糖,是一種良好的免疫調(diào)節(jié)劑[14],可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞成熟增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能參與抗腫瘤的作用,研究顯示,其在體外可以抑制人胃癌細(xì)胞株的增殖,并能誘發(fā)人胃癌細(xì)胞凋亡的作用[15]。魏佳等[16]研究顯示黃芪多糖與吉非替尼聯(lián)用促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞中Ecadherin 表達(dá)水平降低,Vimentin 表達(dá)水平升高,抑制EMT 的進(jìn)程,顯著抑制癌細(xì)胞的增殖。Ecadherin 和Vimentin 在EMT 過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,E-cadherin 表達(dá)減少或缺失是腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的促進(jìn)因子之一[17],而抑制Vimentin 的完整性可抑制間充質(zhì)細(xì)胞遷移[18]。邱艷麗等[19]研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖對(duì)子宮內(nèi)膜癌組織中E-cadherin 基因和蛋白的表達(dá)具有促進(jìn)作用,對(duì)β-catenin 基因和蛋白的表達(dá)具有抑制作用,表明黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白為發(fā)揮抗腫瘤作用。汪一帆等[20]研究顯示抑肺飲(黨參、黃芪、川芎、蜈蚣等)聯(lián)合順鉑對(duì)肺癌移植瘤生長(zhǎng)和Vimentin 蛋白表達(dá)具有明顯抑制作用,并且可上調(diào)E-cadherin 的表達(dá),這表明抑肺飲的作用機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞EMT 相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,黃芪多糖聯(lián)合5-FU 可顯著增加HepG2 細(xì)胞中E-cadherin mRNA 和蛋白的表達(dá),顯著降低HepG2 細(xì)胞中vimentin mRNA 和蛋白的表達(dá),而且,兩種藥物的聯(lián)合效果也顯著優(yōu)于各自單獨(dú)使用時(shí)的效果,說(shuō)明黃芪多糖可以通過(guò)調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞HepG2 的EMT 進(jìn)程增強(qiáng)5-FU 的治療效果。

CXCR4 可以通過(guò)SDF-1/CXCR4 生物軸,調(diào)控腫瘤細(xì)胞的EMT 過(guò)程,進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲等行為[21]。研究顯示,在肝癌、肺癌、乳腺癌等細(xì)胞中CXCR4 均存在高表達(dá),而在正常組織中低表達(dá)或者不表達(dá)[20,22-23]。Kaemmerer 等[24]研究發(fā)現(xiàn)CXCR4 在肝癌中的表達(dá)率約50%,這種高表達(dá)預(yù)示著不良預(yù)后。CXCR4 還參與了機(jī)體免疫應(yīng)答及腫瘤耐藥性[25],因此,CXCR4 可能作為一個(gè)疾病進(jìn)展的標(biāo)志物。本研究中顯示,黃芪多糖聯(lián)合5-FU 可顯著降低HepG2 細(xì)胞中CXCR4 mRNA 和蛋白的表達(dá),與單使用5-FU 治療組相比,黃芪多糖聯(lián)合5-FU組效果更為顯著,說(shuō)明黃芪多糖增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)5-FU的敏感性,從而有效起到抑制肝癌細(xì)胞HepG2 增殖和侵襲的行為。

綜上所述,黃芪多糖可以增強(qiáng)5-FU 抗腫瘤作用;黃芪多糖和5-FU 聯(lián)合使用可抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移作用,可能與抑制肝癌EMT 有關(guān)。這為黃芪多糖對(duì)肝癌臨床輔助治療提供了重要支持。