楊 奕，姜文君，張惠文

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院上海市兒科醫(yī)學(xué)研究所小兒內(nèi)分泌與遺傳代謝病研究室，上海200092

軟骨- 毛發(fā)發(fā)育不全（cartilage-hair hypoplasia，CHH，OMIM #250250） 由McKusick 于1965 年 首 次 報(bào)道［1］，也被稱為McKusick 型干骺端軟骨發(fā)育不全或短肢侏儒免疫缺陷癥，為一種罕見的常染色體隱性遺傳性疾病。CHH 已經(jīng)在多個(gè)國(guó)家陸續(xù)被報(bào)道，目前在阿米什人及芬蘭人中發(fā)病率最高，分別為1/1 000～2/1 000［2］和1/23 000［3］。

該病是由于線粒體處理RNA的內(nèi)切酶復(fù)合物RNA組分（RNA component of mitochondrial RNA processing endoribonuclease，RMRP）基因突變導(dǎo)致。RMRP 基因編碼MRP 核糖核酸酶的RNA 組分，為一非編碼RNA［4］。目前100余種RMRP 基因致病突變位點(diǎn)被相繼報(bào)道，最常見的致病突變是g.70A→G，在阿米什人中發(fā)生率為100%，芬蘭人中為92%［5-6］。臨床主要表現(xiàn)為身材矮小、四肢短小且與軀干不成比例、毛發(fā)細(xì)軟稀疏、骨骺端軟骨發(fā)育不良等；此外，多伴有多系統(tǒng)異常，如不同程度的免疫缺陷、再生不良性貧血、惡性腫瘤、先天性巨結(jié)腸、精子形成異常、皮膚及內(nèi)臟肉芽腫等其他臨床表現(xiàn)也被相繼報(bào)道［2］。該病臨床表現(xiàn)差異顯著，且缺乏特異性，早期診斷困難。

CHH 在我國(guó)的發(fā)病率尚不清楚。1995 年國(guó)內(nèi)報(bào)道2例，為家系同胞兄弟，2 人均以短肢性侏儒、雙下肢畸形、毛發(fā)色淡為主要臨床表現(xiàn)，且伴有魚鱗狀皮損和智力低下，未進(jìn)行基因檢測(cè)［7］。目前，國(guó)內(nèi)鮮有該病的報(bào)道。不排除該病臨床表現(xiàn)多樣、臨床醫(yī)師認(rèn)識(shí)不足的可能。目前，已知基因的全外顯子測(cè)序是診斷疑難雜癥、罕見病的常規(guī)方法；但是RMRP 基因?yàn)榉蔷幋aRNA，沒(méi)有外顯子，不在探針列表。因此，該病若選擇使用全外顯子測(cè)序檢測(cè)，找不到突變位點(diǎn)。目前進(jìn)行CHH 診斷，必須在臨床疑似基礎(chǔ)上，選擇第一代測(cè)序技術(shù)，即進(jìn)行RMRP 基因Sanger 測(cè)序，方可檢出致病變異。本文對(duì)1 個(gè)CHH家系進(jìn)行臨床表型及遺傳學(xué)特點(diǎn)分析。

1 臨床資料

1.1 患兒基本情況

先證者，女，4 歲4 個(gè)月，因“自幼身高增長(zhǎng)緩慢及雙下肢較短”就診?；純合礕3P1，足月剖宮產(chǎn)（孕母妊娠期高血壓），出生體質(zhì)量3.1 kg，出生身長(zhǎng)具體不詳，否認(rèn)出生窒息及搶救史，父母非近親結(jié)婚。母孕期多次超聲檢查提示四肢偏短，具體不詳。生后喂養(yǎng)可，按時(shí)添加輔食，自幼身高增長(zhǎng)緩慢，毛發(fā)稀少且生長(zhǎng)緩慢。3月齡體檢示身高落后，13.3月齡身高為65.5 cm（<-3SD），體質(zhì)量為7.5 kg（<-2SD），明顯落后于同齡兒。體格生長(zhǎng)記錄見圖1。當(dāng)時(shí)于外院行數(shù)字化X 線片檢查提示尺骨遠(yuǎn)端杯口樣改變，胸椎、腰椎生理曲度存在，形態(tài)可，未見明顯異常改變。頭顱磁共振檢查未見明顯異常。運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言及智力發(fā)育正常。父親身高178 cm，母親身高163 cm，父親幼時(shí)有“O”形腿表現(xiàn)，無(wú)家族遺傳性疾病。

圖1 先證者身高（A）及體質(zhì)量（B）記錄Fig 1 Body length（A） and body weight（B） records of the proband

體格檢查：身高89 cm （< -3SD），坐高52 cm（< -2SD），指間距77.5 cm，體質(zhì)量12.6 kg（< -2SD）。神志清楚，精神反應(yīng)可。面容無(wú)特殊，毛發(fā)稀疏、色淺，步態(tài)正常，四肢偏短，胸廓無(wú)突出，肋緣無(wú)外翻，膝關(guān)節(jié)無(wú)外翻，脊柱畸形（-），臀部后翹。背部少許蒙古斑。心、肺、腹未見明顯異常，神經(jīng)系統(tǒng)查體陰性。輔助檢查：血甲狀腺激素、甲狀旁腺激素、血鈣、血鎂、總25-羥維生素D 及堿性磷酸酶水平未見明顯異常，血磷1.34 mmol/L，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（insulin-like growth factor-1，IGF-1）103 ng/mL，胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3（insulin-like growth factor binding protein-3， IGFBP-3）4.87 μg/mL。左手X 線片提示骨齡5 歲（圖2A）。下肢正側(cè)位數(shù)字化X 線片提示右股骨下端及右脛骨兩側(cè)干骺端密度偏高，周圍軟組織未見明顯異常（圖2B～D）。胸腰椎正側(cè)位X 線片提示胸腰椎生理曲度存在，未見側(cè)彎及滑脫，諸椎體及附件形態(tài)尚可，骨質(zhì)未見明顯異常，諸椎間隙未見明顯狹窄（圖2E、F）。

圖2 先證者影像學(xué)檢查Fig 2 Radiographs of the proband

1.2 基因突變檢測(cè)方法

1.2.1 樣本DNA 的制備 在獲得知情同意后抽取患兒及父母靜脈血2 mL，用乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）抗凝。用血液基因組DNA 提取試劑盒（Omega，美國(guó)）提取全基因組DNA。

1.2.2 全外顯子基因測(cè)序分析 首先使用HiSeq 2500 高通量模式測(cè)序，按HiSeq 2500 標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。先將上述步驟中提取的DNA 片段化。制備文庫(kù)。目標(biāo)序列測(cè)序覆蓋度不低于99%。用探針捕獲遺傳性疾病panel 的外顯子及鄰近區(qū)域，最后送高通量測(cè)序平臺(tái)HiSeq 2500（Illumina，美國(guó)）進(jìn)行測(cè)序。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，得到高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果并進(jìn)行分析。應(yīng)用MaxEntScan 軟件對(duì)剪切位點(diǎn)變異進(jìn)行危害性預(yù)測(cè)。變異位點(diǎn)經(jīng)單核苷酸多 態(tài) 性 數(shù) 據(jù) 庫(kù) （database of single nucleotide polymorphisms，dbSNP）、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù)（Exome Aggregation Consortium，ExAC）、外顯子組測(cè)序項(xiàng)目（Exome Sequencing Project，ESP）等頻率數(shù)據(jù)庫(kù)及人類基因變異數(shù)據(jù)庫(kù)（human gene mutation database，HGMD）、NCBI 臨 床 突 變 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（ClinVar）等疾病數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)注釋及疾病風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1.2.3 一代測(cè)序（Sanger 法）檢測(cè) 采用直接擴(kuò)增先證者RMRP 基因及父母驗(yàn)證的方法，并將擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行測(cè)序。分析測(cè)序結(jié)果并與標(biāo)準(zhǔn)序列（序列號(hào)：NG_017041.1）比對(duì)，尋找突變位點(diǎn)。

1.3 基因測(cè)序結(jié)果

該家系進(jìn)行全外顯子基因測(cè)序分析后，結(jié)果提示COL10A1，c.2T→C 基因雜合變異，該位點(diǎn)變異來(lái)源于父親。該基因變異可引起脊柱骨骺發(fā)育不良，主要累及脊柱骨骺和長(zhǎng)骨末端骨骺致進(jìn)行性骨軟骨發(fā)育不良。該病遺傳模式為常染色體顯性遺傳。若該位點(diǎn)變異有致病性，先證者父親應(yīng)有骨病表現(xiàn)。但是父親身高正常，因此推斷該位點(diǎn)為罕見良性變異。同時(shí)檢測(cè)出以下基因變異：HERC2（c. 9939C→T， c. 7231_7245delTGCCAGTGCTTGGCT，常染色體隱性遺傳）；FAM111A（c.1628C→A，常染色體顯性遺傳）；LRP5（c.1395A→C，常染色體顯性遺傳）；CPS1（c.213C→T，c.195C→T，常染色體隱性遺傳）；KLHL24（c.1702G→T，常染色體顯性遺傳）；但因基因型與臨床表型不相符或致病性弱，予排除。

進(jìn)一步分析臨床特征，患兒頭發(fā)稀疏，身材顯著矮小且不對(duì)稱，考慮CHH，因此進(jìn)行RMRP 基因一代測(cè)序（Sanger 法）檢測(cè)。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，先證者RMRP 基因存在復(fù)合雜合變異，基因型為g.181G→A/g.255C→T。前者來(lái)源于父親，已有相關(guān)文獻(xiàn)［6］報(bào)道；后者來(lái)源于母親，根據(jù)美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics，ACMG）指南［8］，從突變頻率、遺傳方式、家系分離及表型高度相符等方面進(jìn)行評(píng)級(jí)，結(jié)果為可能致?。╨ikely pathogenic，PM2+PM3+PP1+PP4-M），未在HGMD報(bào)道過(guò)，為新發(fā)現(xiàn)的突變（圖3）。

圖3 家系RMRP基因Sanger測(cè)序峰圖Fig 3 RMRP gene Sanger sequencing of the family

2 討論

本研究分析了1例CHH 患兒的臨床表現(xiàn)。患兒運(yùn)動(dòng)、語(yǔ)言及智力發(fā)育正常，以生長(zhǎng)落后、非勻稱性矮小、四肢偏短、毛發(fā)稀疏為主要癥狀，這與CHH 最常累及肌肉骨骼系統(tǒng)有關(guān)。典型的CHH 患者出生身長(zhǎng)常小于平均值，在生后2年內(nèi)即出現(xiàn)身高增加緩慢，青春期生長(zhǎng)加速可能很小甚至無(wú)［9］。既往相關(guān)文獻(xiàn)［10］報(bào)道，CHH 男性患者成年中位數(shù)身高為131.1 cm（110.7～149.0 cm），女性患者成年中位數(shù)身高為122.5 cm（103.7～137.4 cm）。

患兒有毛發(fā)生長(zhǎng)異常及形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為纖細(xì)、稀疏、色淺，“絲質(zhì)”發(fā)，容易折斷。van der Burgt 等［11］學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CHH 患兒毛發(fā)微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，毛干直徑變小，為正常毛發(fā)直徑的50%～60%，成分改變，拉伸試驗(yàn)提示比正常毛發(fā)脆弱、易斷。

本病例影像學(xué)檢查均提示骨發(fā)育異常。以累及干骺端及骨骺為特點(diǎn)，最常累及雙下肢，表現(xiàn)為干骺端出現(xiàn)齒狀邊緣，呈喇叭口樣、硬化［12］，且干骺端異常的程度與生長(zhǎng)速度及最終身高相對(duì)應(yīng)。臨床病例研究［13］表明，尺骨和橈骨長(zhǎng)度短于肱骨，股骨長(zhǎng)度短于脛骨，脛骨比腓骨受累更嚴(yán)重。CHH 患者中軸骨大小也受累，提示該綜合征中存在全身骨骼生長(zhǎng)功能障礙。該病還可有腕關(guān)節(jié)或踝關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)松弛、肘部伸展受限、腰椎前凸、踝關(guān)節(jié)內(nèi)翻、膝關(guān)節(jié)內(nèi)翻、脊柱側(cè)凸等改變；其中腰椎前凸加重、韌帶松弛和脊柱側(cè)凸常見，并且與年齡有關(guān)［13］。本研究中CHH 患兒僅有上述部分特征性相關(guān)改變，考慮可能與發(fā)病年齡及病程有關(guān)。

CHH患者臨床表現(xiàn)多樣化，可累及多器官、多系統(tǒng)，骨骼影像學(xué)改變不典型，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)無(wú)特異性指標(biāo)，診斷較困難，目前尚無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)臨床診斷主要依據(jù)四肢非均勻性矮小、毛發(fā)細(xì)軟稀疏等典型的臨床表現(xiàn)以及骨骺軟骨發(fā)育異常的影像學(xué)特征，伴有免疫缺陷、大紅細(xì)胞性貧血以及消化系統(tǒng)異常等其他癥狀可提示診斷。對(duì)于臨床特征不明顯的患者，需與臨床表現(xiàn)相似的疾病進(jìn)行鑒別診斷，并通過(guò)RMRP 基因突變分析明確診斷并指導(dǎo)產(chǎn)前診斷。

RMRP 基因位于染色體9p13，無(wú)內(nèi)含子及外顯子，轉(zhuǎn)錄本包括3 個(gè)啟動(dòng)子——鄰近序列元件（proximal sequence element，PSE）、TATA盒、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上游的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)［4，14］。該基因產(chǎn)生長(zhǎng)度為268 bp 的非編碼RNA，無(wú)外顯子，不編碼蛋白質(zhì)，不在常見全外顯子檢測(cè)試劑盒的探針列表。本病若使用全外顯子測(cè)序檢測(cè)，找不到致病性基因突變位點(diǎn)。對(duì)于疑似CHH 的臨床病例，在行基因檢查時(shí)需針對(duì)性進(jìn)行RMRP 一代測(cè)序（Sanger 法）檢測(cè)，且測(cè)序范圍應(yīng)包含轉(zhuǎn)錄區(qū)和啟動(dòng)子區(qū)等整條基因。

RMRP基因致病突變多數(shù)發(fā)生在編碼區(qū)，如本例患兒RMRP基因復(fù)合雜合變異，基因型為g.181G→A/g.255C→T，前者來(lái)源于父親，后者來(lái)源于母親。突變g.255C→T為新發(fā)現(xiàn)，豐富了該疾病基因突變譜。RMRP基因在啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄區(qū)及終止密碼子后的突變也有相關(guān)報(bào)道［15］。RMRP 致病突變可導(dǎo)致線粒體RNA 內(nèi)切酶活性降低，引起rRNA與mRNA裂解減少，核糖體組裝及細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)生障礙［16-17］。rRNA 裂解受損與骨發(fā)育不良的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，mRNA 裂解減少與毛發(fā)發(fā)育不全、免疫缺陷、血液學(xué)異常改變及罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)［15，18］，因此臨床上可呈現(xiàn)多系統(tǒng)異常表現(xiàn)。本研究中的患兒尚未出現(xiàn)免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)及腫瘤病變，需要進(jìn)一步的專科隨訪。

有些疾病的臨床表現(xiàn)與CHH 相似，鑒別診斷包括其他常染色體隱性遺傳性骨骼發(fā)育不良以及矮小癥（可能伴有免疫功能缺陷），如不伴稀毛癥的干骺端發(fā)育不良（OMIM #250460）、嚴(yán)重骨骼發(fā)育不良改變（OMIM#607095） 及Shwachman-Diamond 綜 合 征（OMIM #260400）［15］。

目前，尚未發(fā)現(xiàn)針對(duì)CHH 疾病的特效療法。一般采用對(duì)癥治療手段。針對(duì)矮小癥患兒，重組人生長(zhǎng)激素的治療目前尚存在爭(zhēng)議［19-20］，因其可能增加罹患腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)。針對(duì)反復(fù)嚴(yán)重感染或合并嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的患兒，可行骨髓移植或造血干細(xì)胞移植治療［21］。本研究患兒尚未出現(xiàn)貧血、嚴(yán)重骨骼畸形、內(nèi)分泌異常及腫瘤改變。為更科學(xué)診治CHH 患兒，應(yīng)建立?？齐S訪制度。不伴有多系統(tǒng)異常的患兒，每1～2 年至少隨訪1 次，隨訪內(nèi)容應(yīng)根據(jù)患兒年齡及病情嚴(yán)重程度制定。專科隨訪時(shí)進(jìn)行體格檢查、營(yíng)養(yǎng)狀況評(píng)估，行骨齡及肢關(guān)節(jié)X 線檢查評(píng)估骨骼發(fā)育情況。若合并內(nèi)分泌系統(tǒng)異常，建議每3個(gè)月門診隨訪，評(píng)估身高線性生長(zhǎng)情況、身材比例及青春期發(fā)育情況；對(duì)于使用重組人生長(zhǎng)激素治療的患兒，同時(shí)應(yīng)完善肝功能、血糖、血尿常規(guī)、甲狀腺功能、IGF-1 等檢驗(yàn)［20］。長(zhǎng)期隨訪有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)患兒的臨床并發(fā)癥，并進(jìn)行早期干預(yù)，改善疾病預(yù)后。