楊潤澤，許文寧，鄭火亮，蔣盛旦

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院脊柱中心，上海200092

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是全球較常見的關(guān)節(jié)疾病。據(jù)報道，約10%的男性和13%的女性在60 歲以上會發(fā)生膝關(guān)節(jié)OA［1］。由于人口老齡化和肥胖癥的增多，OA 的發(fā)病率也不斷增加［2］。OA 患者常伴有關(guān)節(jié)軟骨進行性破壞、關(guān)節(jié)積液、行動能力喪失等［3］。軟骨細胞是軟骨中唯一的細胞類型，在OA 發(fā)病過程中會發(fā)生多種變化，例如增殖和分泌能力的改變［4］。軟骨細胞的異常凋亡、炎癥反應(yīng)等與OA 中軟骨降解有關(guān)［5-6］。因此，探討軟骨細胞功能障礙的機制有助于OA 的診斷和治療。OA常常伴隨有不同程度炎癥的發(fā)生，在其炎癥發(fā)展的過程中，白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）發(fā)揮著重要的作用，可通過促進炎癥介質(zhì)前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）及一氧化氮（nitric oxide，NO）等的釋放激活炎癥反應(yīng)［7］。外泌體作為細胞內(nèi)吞過程中主動分泌的直徑為50～100 nm的囊泡，具有脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)，可以從不同的細胞類型中釋放，并已被證明在細胞通信中起到重要作用。外泌體可以在血液及關(guān)節(jié)滑液中穩(wěn)定存在［8］。越來越多的證據(jù)［9］表明，外泌體參與OA、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病的發(fā)展。外泌體分泌或攝取失調(diào)可以導(dǎo)致急慢性炎癥，繼而引起軟骨變性和關(guān)節(jié)破壞［10］。血管內(nèi)皮細胞在人體內(nèi)廣泛分布，其分泌的外泌體對多種疾病的發(fā)生發(fā)展有重要作用，例如骨質(zhì)疏松、糖尿病等［11-12］，但血管內(nèi)皮細胞分泌的外泌體在OA中的作用未有詳細報道。本研究利用IL-1β 刺激前軟骨細胞建立OA 體外模型，探究血管內(nèi)皮細胞分泌的外泌體對于OA的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM 高糖細胞培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購自美國Gibco 公司，IL-1β 購自上海達科為生物技術(shù)公司，活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技公司，RIPA 裂解液、BCA 試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯影試劑、4%多聚甲醛固定液、Annexin V-FITC 細胞凋亡檢測試劑盒、C1090 一步法末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記法（TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購自上海碧云天生物技術(shù)公司，白細胞分化抗原9（cluster differentiation 9，CD9； 20597-1-AP）、 凋 亡 相 關(guān) 基 因2 互 作 蛋 白X（apoptosis linked gene-2-interacting protein X，Alix；12422-1-AP）、腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，Tsg101；14497-1-AP）、裂解的半胱天冬酶3 （cleaved caspase-3，c-caspase-3；19677-1-AP）、B淋巴細胞瘤2（Bcell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2；12789-1-AP）、Bcl-2相關(guān)X 蛋 白（Bcl-2 associated X protein，Bax；50599-2-Ig）、Kelch 樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap-1；10503-2-AP）、核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2 related factor 2，Nrf-2；16396-1-AP）、βactin（66009-1-Ig）抗體購自中國Proteintech公司，血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1；sc-390991）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸醌氧化還原酶1（NADPH quinone oxidoreductase-like protein 1，NQO-1；sc-32793）抗體購自美國Santa Cruz 公司，總外泌體分離試劑盒購自美國Invitrogen公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人臍靜脈內(nèi)皮細胞 （human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）、小鼠前軟骨細胞株ATDC5 購自ATCC 公司。細胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基（DMEM 高糖培養(yǎng)液，含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 鏈霉素）中，在37 ℃、5% CO2環(huán)境下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)2～3 d根據(jù)細胞生長情況換液。其中HUVEC常規(guī)培養(yǎng)至細胞密度達80%以上時更換為無血清DMEM 高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集細胞培養(yǎng)液。

1.3 外泌體的分離與鑒定

1.3.1 外泌體分離方法 收集2×107個HUVEC 的培養(yǎng)液，按照試劑盒說明書分離外泌體。4 ℃、500×g 離心5 min 后收集上清液，4 ℃、2 000×g 離心1 h 后，丟棄沉淀，吸取上清液后，與一半體積的試劑盒中的外泌體提取液混勻后，4 ℃過夜。第2日，4 ℃、10 000×g離心1 h后，去除上清液，用1 mL 無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）重懸沉淀，再次4 ℃、10 000×g 離心70 min 后，棄上清液，用200 μL PBS 溶解沉淀即可獲得外泌體。

1.3.2 透射電鏡觀察外泌體形態(tài) 取新鮮提取的外泌體懸液10 μL，滴加到銅網(wǎng)上，室溫過夜干燥后，使用乙酸雙氧鈾復(fù)染。隨后透射電鏡（美國Delong 公司）上機成像觀察并拍照保存。

1.3.3 納米顆粒跟蹤分析 取100 μL外泌體懸液，用1×PBS 稀釋10 倍后，置于比色皿中后放入粒度儀（新西蘭Izon Science公司）中檢測外泌體粒徑分布。

1.3.4 Western blotting 檢測外泌體標(biāo)志物 向200 μL 外泌體懸液中加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min 后，4 ℃、12 000×g 離心10 min，取上清液。BCA 法測定蛋白濃度后。取適量5×十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液，100 ℃煮10 min 后，冷卻到室溫。按照每孔20 μg 蛋白樣品上樣，設(shè)置80 V 電壓電泳約30 min，調(diào)整電壓到120 V，待溴酚藍進入到凝膠底部終止電泳。選用PVDF 膜，濕轉(zhuǎn)70 min，使用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗CD9（1∶1 000）、Alix （1∶1 000）、Tsg101（1∶1 000） 4 ℃孵育過夜。二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，ECL 反應(yīng)后，曝光顯影并保存圖像。

1.4 外泌體攝取實驗

使用稀釋后的PKH26 熒光染料（美國Sigma 公司），在避光條件下對20 μL 外泌體的磷脂雙分子膜染色5 min后，加入等體積10%的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）終止染色后重懸外泌體沉淀。將染色后的外泌體加入到ATDC5 培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)3 h 和6 h。待共培養(yǎng)結(jié)束后，去除細胞培養(yǎng)上清液后，PBS 清洗；加入4%多聚甲醛避光固定后，DAPI 染細胞核，再次PBS清洗；加入抗熒光淬滅劑，熒光顯微鏡（德國Leica 公司）觀察拍照。

1.5 細胞分組及處理方法

將ATDC5 細胞分為空白對照（NC）組、IL-1β 組、IL-1β+50 μg 外泌體組、IL-1β+100 μg 外泌體組。除了NC 組外，每組均加入10 ng/mL IL-1β，模擬OA 體外模型；其中IL-1β+50 μg 外泌體組和IL-1β+100 μg 外泌體組，再分別加入50 μg及100 μg外泌體，作用24 h。

1.6 細胞內(nèi)ROS水平檢測

將ATDC5 細胞培養(yǎng)于6 孔板上，待細胞密度為60%～70%時，分別加入500 μL PBS、10 ng/mL IL-1β、10 ng/mL IL-1β+50 μg外泌體、10 ng/mL IL-1β+100 μg外泌體，作用24 h 后，棄細胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌，加入2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2'，7'-dichlorofluorescein-diacetate，DCFH-DA）熒光探針避光染色30 min，PBS 洗滌后熒光顯微鏡檢測橙色熒光。

1.7 細胞凋亡檢測

1.7.1 TUNEL 檢測ATDC5 細胞凋亡 使用一步法TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。ATDC5細胞按上述細胞處理方法處理完畢后，去除培養(yǎng)液，PBS 洗滌1次，4%多聚甲醛固定細胞30 min，PBS洗滌1次后加入免疫染色強力通透液室溫孵育5 min。PBS 洗滌2 次，再加入配置好的TUNEL 檢測液37 ℃避光孵育60 min，孵育結(jié)束后PBS 洗滌3 次，并使用DAPI 復(fù)染細胞核，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.7.2 流式細胞術(shù)檢測ATDC5細胞凋亡 ATDC5細胞按密度為6×105個/mL接種于6孔板，除空白對照（不進行任何處理） 和Annexin V-FITC 或碘化丙啶（propidium iodide，PI）單染外，細胞分為3組：正常對照組（Annexin V-FITC 和PI 雙染）、10 ng/mL IL-1β 組、10 ng/mL IL-1β+100 μg 外泌體組。孵育24 h 后，PBS 洗滌2 次，0.25%胰酶消化，終止消化后，300×g離心5 min，收集細胞；用預(yù)冷的PBS重懸后再次離心棄上清液，加入200 μL結(jié)合緩沖液懸浮細胞，加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混勻，室溫避光孵育15 min 后，流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）檢測細胞早期和晚期凋亡情況。

1.8 Western blotting 測定細胞中凋亡蛋白和抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達

按上述細胞處理方法分組干預(yù)24 h后收集細胞，PBS洗滌2 次，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min 后，用細胞刮刀刮下裂解后的細胞，離心，提取細胞總蛋白，取10 μL 蛋白樣品，利用BCA 法測蛋白濃度后，蛋白樣品（20 μg 總蛋白）于12%SDS-PAGE凝膠上分離蛋白組分。一抗HO-1（1∶1 000）、NQO-1（1∶1 000）、Nrf-2 （1∶1 000）、Keap-1 （1∶1 000）、c-caspase-3 （1∶1 000）、Bcl-2 （1∶1 000）、Bax （1∶1 000），4 ℃孵育過夜，次日TBST 緩沖液漂洗后二抗（1∶2 000）室溫孵育1 h，ECL 反應(yīng)曝光顯影后保存結(jié)果進行分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理。定量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05認為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUVEC來源外泌體的結(jié)構(gòu)特征

透射電鏡下可以觀察到HUVEC分泌的外泌體呈現(xiàn)脂質(zhì)雙層膜包繞形成的典型茶托狀形態(tài)特征（圖1A）。利用Western blotting 可檢測到其蛋白標(biāo)志物CD9、Alix 和Tsg101 的表達（圖1B）。粒度分析檢測表明，HUVEC 來源的外泌體粒徑主要分布在100～200 nm（圖1C）。

圖1 HUVEC來源外泌體的鑒定Fig 1 Identification of HUVEC-derived exosomes

2.2 ATDC5細胞對HUVEC來源外泌體的攝取

熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示，被PKH26熒光染料標(biāo)記的外泌體與ATDC5細胞共培養(yǎng)6 h后，外泌體可被ATDC5細胞成功攝取至細胞質(zhì)中，并在細胞核周圍聚集（圖2）。

圖2 熒光染料PKH26標(biāo)記的外泌體與ATDC5細胞共培養(yǎng)3 h和6 h后的攝取情況Fig 2 Uptaking of PKH26-labeled exosomes co-cultured with ATDC5 cells for 3 h and 6 h

2.3 HUVEC 來源外泌體對于IL-1β 刺激下的ATDC5 細胞ROS生成的影響

與NC 組相比，10 ng/mL IL-1β 作用ATDC5 細胞24 h后，細胞內(nèi)的ROS橙色熒光增強；同時加入50 μg外泌體和10 ng/mL IL-1β 刺激24 h 后，與單純IL-1β 刺激相比，ATDC5細胞內(nèi)ROS橙色熒光強度進一步增加（圖3）。

圖3 ATDC5細胞內(nèi)ROS檢測Fig 3 Detection of ROS in ATDC5 cells

2.4 HUVEC 來源外泌體對于IL-1β 刺激下ATDC5 細胞凋亡的影響

利用TUNEL 染色和流式細胞術(shù)檢測ATDC5 細胞凋亡，TUNEL 染色結(jié)果顯示：與NC 組相比，10 ng/mL IL-1β 刺激24 h 組細胞凋亡率升高，同時加入50 μg 外泌體后，ATDC5細胞凋亡率進一步升高（圖4A、B）。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果也顯示：與NC 組相比，10 ng/mL IL-1β 刺激24 h 組ATDC5 細胞總凋亡率升高，同時加入50 μg 外泌體后，ATDC5細胞總凋亡率進一步升高（圖5A、B）

圖4 TUNEL法檢測ATDC5細胞凋亡Fig 4 Detection of apoptosis of ATDC5 cells by TUNEL assay

圖5 流式細胞術(shù)檢測ATDC5細胞凋亡Fig 5 Detection of apoptosis of ATDC5 cells by flow cytometry

2.5 HUVEC 來源外泌體對IL-1β 刺激下ATDC5 細胞凋亡和抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達的影響

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，炎癥因子IL-1β 處理ATDC5 細 胞24 h 的IL-1β 組，凋 亡 相 關(guān) 蛋 白Bax、c-caspase-3 表達量較NC 組明顯上升，Bcl-2 表達量較NC組下降；而與IL-1β 組相比，IL-1β+50 μg 外泌體組和IL-1β+100 μg 外泌體組的Bax、c-caspase-3 表達量進一步上升，Bcl-2 的表達量逐漸下降（圖6A）。按上述分組，抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白Nrf-2、HO-1、NQO-1的表達量逐漸下降，Keap-1表達量逐漸升高（圖6B）。

圖6 Western blotting檢測ATDC5細胞中凋亡及抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達Fig 6 Detection of the expression of apoptosis-and anti-oxidative stress-related proteins in ATDC5 cells by Western blotting

3 討論

OA 常見于中老年人群，疾病進展到后期可對患者的生活質(zhì)量和身心健康產(chǎn)生較大影響。軟骨細胞主要存在于軟骨基質(zhì)中，被認為是參與OA 發(fā)生和發(fā)展的主要組分，其損傷和凋亡均會直接影響OA 的進程［13］。炎癥因子IL-1β 已被證實參與OA 發(fā)病中軟骨細胞的損傷變性［14］，故本研究使用IL-1β建立OA體外模型。

作為近年來研究熱點之一的外泌體，起初被認為是細胞代謝的廢棄物。后來研究［15］發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)容物多種多樣，對細胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起重要作用。研究［16］表明，多種細胞來源的外泌體對于骨缺損的修復(fù)有促進作用。作為體內(nèi)分布廣泛的血管內(nèi)皮細胞，其分泌的外泌體對于OA是否有影響未見報道。

本研究擬探討HUVEC 分泌的外泌體對于OA 是否有影響。使用試劑盒分離并鑒定外泌體后，通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)同時加入HUVEC來源的外泌體組比單獨使用IL-1β 作用24 h 后的實驗組，產(chǎn)生更多的ROS。既往研究［17］表明，由過多自由基（如ROS）引發(fā)的氧化應(yīng)激是軟骨降解和導(dǎo)致OA的主要原因，且氧化應(yīng)激增多會導(dǎo)致細胞凋亡增多［18］。通過流式細胞術(shù)和TUNEL 染色觀察發(fā)現(xiàn)NC 組、IL-1β 組、IL-1β+50 μg 外泌體組的ATDC5細胞凋亡率逐漸升高，說明HUVEC 來源外泌體對于IL-1β 刺激的ATDC5 細胞的凋亡有促進作用。據(jù)文獻［19］報道，細胞的一些氧化應(yīng)激反應(yīng)依賴于Keap-1/Nrf-2/HO-1信號通路；通常情況下Keap-1與Nrf-2在細胞質(zhì)中結(jié)合，這時處于未激活狀態(tài)，若其一直未被激活，Nrf-2 會被泛素化進而被降解。在炎癥、饑餓等條件刺激下，Keap-1與Nrf-2的結(jié)合變得不穩(wěn)定，Nrf-2被釋放出來，轉(zhuǎn)移至細胞核，激活下游的過氧化物酶，從而起到抗氧化應(yīng)激的作用［20］。根據(jù)既往研究［21-22］，一些物質(zhì)例如微RNA、糖蛋白等可以通過影響Keap-1/Nrf-2/HO-1 通路以減輕氧化應(yīng)激。因此，我們猜想HUVEC來源的外泌體可以通過影響Keap-1/Nrf-2/HO-1 通路，以加重氧化應(yīng)激從而導(dǎo)致ATDC5 細胞凋亡。Western blotting、ROS 含量檢測及細胞凋亡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HUVEC來源的外泌體使得ROS含量進一步增加，加重IL-1β 刺激ATDC5 細胞引起的細胞凋亡，同時Keap-1表達升高，Nrf-2、HO-1、NQO-1表達下降，即細胞抗氧化應(yīng)激能力下降。但HUVEC來源外泌體對ATDC5 細胞的凋亡和抗氧化應(yīng)激通路產(chǎn)生影響的具體機制，有待于更深入的研究。

綜上所述，HUVEC 來源的外泌體可能通過影響Keap-1/Nrf-2/HO-1抗氧化應(yīng)激信號通路從而增加IL-1β刺激下ATDC5 細胞內(nèi)的ROS 產(chǎn)生，使得ATDC5 細胞凋亡增加。HUVEC 來源的外泌體對于OA 不能起到治療性作用，且會加重軟骨損傷程度，這為OA的診治提供了新的思路。因此抑制HUVEC 來源外泌體的作用可能對OA 起到治療性作用，而若要抑制某種外泌體的作用，需要進一步揭示其中發(fā)揮作用的具體分子，并針對具體分子進行靶向抑制，這為我們下一步的研究指明了方向。