李 歡，易培強(qiáng)，蘇 筠，陳培戰(zhàn)，許 赬，曹 璐，陳佳藝，李 敏

1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院腫瘤放射治療科，上海200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院北院中心實(shí)驗(yàn)室，上海201801

放射治療是惡性腫瘤綜合治療不可或缺的組成部分。據(jù)報(bào)道，約52.3%的腫瘤患者在其腫瘤診治過程中需要進(jìn)行放射治療［1］。放射治療相關(guān)正常組織損傷是腫瘤多學(xué)科綜合治療中的重要臨床問題。放射性心臟疾?。╮adiation-induced heart disease，RIHD）已成為胸部惡性腫瘤放射治療遠(yuǎn)期非腫瘤死亡的主要原因之一，常發(fā)生于霍奇金淋巴瘤［2-3］和早期乳腺癌［4-5］這些有較長生存期和隨訪時(shí)間的患者。隨著放射治療技術(shù)的快速發(fā)展，現(xiàn)代是以調(diào)強(qiáng)技術(shù)為主流的放射治療時(shí)代，心臟及其亞結(jié)構(gòu)的受照劑量明顯下降。但是，在平衡腫瘤靶區(qū)劑量覆蓋和最大限度地降低心臟受照劑量時(shí)，放射性心臟毒性仍是重要的關(guān)注點(diǎn)。

心臟的所有亞結(jié)構(gòu)，包括心包、心肌、心瓣膜、傳導(dǎo)系統(tǒng)和冠狀動脈都有可能受到放射損傷［6］。放射相關(guān)心臟疾病類型主要包括冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、心包疾病、瓣膜性心臟病、心力衰竭、心律失常、心肌病等。目前，對于RIHD的治療通常遵循常規(guī)心臟疾病患者的管理標(biāo)準(zhǔn)。由于放射性心肌損傷的潛伏期可長達(dá)10～20年，發(fā)現(xiàn)癥狀時(shí)多數(shù)情況下心臟已有器質(zhì)性的變化。目前的藥物干預(yù)無法達(dá)到預(yù)期的治療效果，且尚無成熟的預(yù)防放射性心肌損傷的藥物。所以亟需探究放射性心肌損傷的發(fā)生、發(fā)展過程，開發(fā)藥物，預(yù)防、修復(fù)和治療放射治療對心臟的損傷。

垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽（pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide，PACAP）是一種最初從羊的下丘腦獲取的神經(jīng)生物多肽。由于其在進(jìn)化過程中結(jié)構(gòu)高度保守，PACAP 被認(rèn)為是血管活性腸多肽/生長激素釋放激素/胰高血糖素超家族的祖先分子，具有PACAP38和PACAP27 2 種生物活性形式［7］。據(jù)報(bào)道［8］，PACAP38是一種具有抗凋亡、抗炎與抗氧化作用的多功能生物活性肽。在心臟中，PACAP 具有正向肌力及舒張血管等作用；在心肌細(xì)胞中，PACAP 具有減輕蒽環(huán)類藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激性損傷的作用。本研究中，探討PACAP38 對放射性心肌損傷的防護(hù)作用，為針對RIHD新型多肽類靶向藥物治療的轉(zhuǎn)化研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株 H9C2 大鼠心室肌母細(xì)胞（CRL-1446） 購自美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection，ATCC），應(yīng)用DMEM 培養(yǎng)基，補(bǔ)充10%的胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和1%的青霉素-鏈霉素雙抗在37 ℃、95%空氣、5%CO2條件下培養(yǎng)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 C57BL/6J 雄性小鼠（20～25 g，6～8周）購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司，在上海嘉定區(qū)育成中心上海君伯生物科技有限公司飼養(yǎng)。動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2017-0005，使用許可證號為SYXK（滬）2018-0003。飼養(yǎng)條件為SPF 級，保持12 h的晝夜節(jié)律，溫度適宜（22～27 ℃），濕度適宜（40%～60%）。所有動物實(shí)驗(yàn)流程按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物管理?xiàng)l例進(jìn)行。

1.1.3 主要試劑和儀器 PACAP38 （A1439，美國Sigma-Aldrich），F(xiàn)BS（16000044，美國Gibco），胰蛋白酶含EDTA （25200056，美國Gibco），二甲基亞砜（D2650，美國Sigma-Aldrich），青霉素-鏈霉素雙抗（15140122，美國Gibco），DMEM 培養(yǎng)基（SH30243，美國Hyclone），TRIzol 試劑（15596026，美國Invitrogen），增強(qiáng)型CCK-8試劑（C0042，上海碧云天），蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，H-E）染液（G1005，武漢谷歌生物）；醫(yī)用直線加速器（Trilogy，美國Varian），倒置熒光顯微鏡（Axio Vert A1，德國Carl Zeiss）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 體外心肌細(xì)胞輻照模型的構(gòu)建 H9C2心肌細(xì)胞隨機(jī)分為6 組：對照組［磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）］、PACAP38 （10-7mol/L） 單 獨(dú) 處 理 組、PACAP38（10-9mol/L）單獨(dú)處理組、輻照（irradiation，IR）組（加PBS）、IR+PACAP38（10-7mol/L）組、IR+PACAP38（10-9mol/L）組。細(xì)胞照射（12 Gy）前2 h，各組細(xì)胞給予PACAP38（10-7或10-9mol/L）或等體積無菌PBS預(yù)處理。PACAP38的劑量選擇（10-9和10-7mol/L）參照本課題組前期研究結(jié)果［9］。

應(yīng)用醫(yī)用直線加速器的X 射線構(gòu)建體內(nèi)外心臟輻照模型，劑量儀為PTW UNIDOS（德國），放射治療計(jì)劃系統(tǒng)為Eclipse 13.6。根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基與頂蓋之間存在氣體的特征，首先在Eclipse 計(jì)劃系統(tǒng)建立細(xì)胞照射虛擬模型，設(shè)定30 cm×30 cm 的照射野，源皮距（source skin distance，SSD） 100 cm，射線能量6 MV，劑量率3 Gy/min，機(jī)臂180°向上，培養(yǎng)皿下放置1 cm 有機(jī)玻璃板作為補(bǔ)償物，上方放置5 cm 有機(jī)玻璃板作為散射體。

1.2.2 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性 制備密度為1 000/mL的細(xì)胞懸液進(jìn)行細(xì)胞鋪板，于照射前2 h 給予PACAP38或PBS 處理細(xì)胞，隨后給予12 Gy 的細(xì)胞輻照。照射后48 h，各孔加入10 μL CCK-8 試劑混勻，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱，繼續(xù)孵育2 h。各組孵育時(shí)間保持一致。應(yīng)用酶標(biāo)儀在450 nm測定吸光度。

1.2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞鋪板數(shù)隨輻照劑量的增大而增加，細(xì)胞輻照劑量依次為0、2、4 和8 Gy 組，鋪板細(xì)胞數(shù)依次為500/0 Gy 組，1 000/2 Gy 組，2 000/4 Gy 和8 000/8 Gy 組。細(xì)胞輻照前2 h 給予PACAP38 或PBS 處理細(xì)胞，隨后給予細(xì)胞照射。輻照后將細(xì)胞放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 周。2 周后依次經(jīng)過無菌PBS 洗滌、多聚甲醛固定15 min、1%結(jié)晶紫染色20 min、流水洗滌及空氣干燥。倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)≥50 的克隆數(shù)。計(jì)算細(xì)胞貼壁率，為對照組集落數(shù)與細(xì)胞種植數(shù)的比值。計(jì)算細(xì)胞存活率，為實(shí)驗(yàn)組集落數(shù)與細(xì)胞種植數(shù)和貼壁率乘積的比值。以輻照劑量為橫坐標(biāo)，細(xì)胞存活率（survival fraction，SF）為縱坐標(biāo)，繪制不同處理組的劑量效應(yīng)曲線，即細(xì)胞存活曲線；利用GraphPad Prism 5.0c 軟件，采用單擊多靶模型進(jìn)行曲線擬合。方程式為SF=1-（1-e-KD）n。其中，n 為外推數(shù)，也稱為靶數(shù)，即細(xì)胞內(nèi)所含放射敏感區(qū)域數(shù)；K 為1/D0，是與射線質(zhì)及細(xì)胞敏感性相關(guān)的常數(shù)；D 為細(xì)胞輻照劑量。

1.2.4 動物心臟輻照模型的構(gòu)建 將48只雄性C57BL/6J小鼠分成4 組：溶劑對照組、PACAP38 對照組、IR 組、IR+PACAP38 組，每組各12 只小鼠。對于需經(jīng)PACAP38處理的小鼠，在輻照前2 h、輻照后24 及48 h 分別給予10μg PACAP38（100μL）腹腔注射；溶劑對照組給予相同體積和次數(shù)的生理鹽水腹腔注射。輻照后繼續(xù)正常飼養(yǎng)，1個(gè)月后脊椎脫臼法處死小鼠獲取標(biāo)本。

小鼠心臟輻照同樣是在醫(yī)用直線加速器上進(jìn)行，心臟輻照的條件如下：射線能量6 MV；劑量/分次為14 Gy/1 Fx；劑量率為300 cGy/min；SSD 為100 cm；補(bǔ)償1 cm固體水；照射野為1 cm×1 cm。照射野的位置主要依據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)對小鼠胸部解剖，明確心臟相對于體表的位置。將小鼠用4%水合氯醛（0.1 mL/10 g）催眠小鼠，然后用強(qiáng)力膠帶固定四肢和尾巴于固體水上，用線將門齒牽拉固定，注意力度，確保小鼠呼吸通暢。

1.2.5 H-E 染色 將心臟組織固定于4%多聚甲醛24 h 以上，隨后經(jīng)過濃度梯度乙醇脫水、浸蠟，進(jìn)行石蠟包埋、切片烤片。H-E染色前先進(jìn)行切片脫蠟，然后將脫蠟至水的切片放入蘇木精染液中浸染3～8 min 以染細(xì)胞核；隨后將切片置于伊紅染液中浸染1～3 min，目的是浸染細(xì)胞質(zhì)；最后進(jìn)行脫水封片，脫水透明后晾干，中性樹膠封片。通過顯微鏡鏡檢，觀察各組心臟組織病理學(xué)改變，圖像采集并標(biāo)注分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad Prism 5.0c進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩獨(dú)立樣本均數(shù)比較應(yīng)用非配對t 檢驗(yàn)，3 個(gè)及以上樣本均數(shù)比較應(yīng)用單因素方差分析和Bonferroni的多重比較。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為xˉ±s。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PACAP38 干預(yù)對輻照誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞毒性的防護(hù)作用

CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞活性的改變，結(jié)果如圖1 所示：輻照48 h 后，IR 組H9C2 細(xì)胞活性［（83.67±0.78）%］較對照組細(xì)胞顯著下降（P=0.000）；在輻照前給予PACAP38 預(yù)處理有效逆轉(zhuǎn)了輻照誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降，10-7與10-9mol/L PACAP38 處理后細(xì)胞活性分別為（98.63±2.70）%和（92.57±0.82）%，與IR 組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000，P=0.014）；PACAP38 單獨(dú)處理組的細(xì)胞活性未見明顯改變。

圖1 PACAP38對輻照誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞毒性的防護(hù)作用Fig 1 Protective role of PACAP38 against IR-induced cytotoxicity in H9C2 cells

2.2 PACAP38干預(yù)對H9C2心肌細(xì)胞輻照敏感性的影響

IR+10-9mol/L 和IR+10-7mol/L PACAP38 處 理 組 經(jīng) 過輻照（0、2、4、8 Gy）后細(xì)胞克隆形成能力明顯提高。以照射劑量為橫坐標(biāo)，細(xì)胞SF 為縱坐標(biāo)，繪制不同處理組的劑量效應(yīng)曲線，即細(xì)胞存活曲線。采用單擊多靶模型進(jìn)行曲線擬合，結(jié)果如圖2 所示。2 Gy 時(shí)的細(xì)胞SF（SF at 2 Gy，SF2）在10-9和10-7mol/L PACAP38 預(yù)處理后從0.53 增加至0.63 和0.70，放射增敏比（sensitization enhancement ratio，SER）在10-9和10-7mol/L PACAP38處理組分別為0.95 和0.91。PACAP38 干預(yù)對平均致死劑量D0及準(zhǔn)閾劑量Dq的影響如表1 所示：10-9和10-7mol/L PACAP38 干預(yù)后D0及Dq均提高，提示PACAP 干預(yù)降低了心肌細(xì)胞的輻照敏感性。

2.3 PACAP38干預(yù)對輻照小鼠心肌組織病理損傷的緩解作用

圖2 PACAP38干預(yù)對H9C2心肌細(xì)胞SF2的影響Fig 2 Effect of PACAP38 intervention on SF2 of H9C2 cells

通過對小鼠心肌組織H-E 染色發(fā)現(xiàn)，PACAP38 干預(yù)可以顯著改善輻照誘導(dǎo)的心肌組織病理損傷，如圖3 所示。與溶劑對照組小鼠相比，IR 組小鼠的左心室心肌組織呈現(xiàn)明顯的損傷性病變，包括心肌細(xì)胞變性、嗜酸性增強(qiáng)、細(xì)胞質(zhì)空泡化、細(xì)胞核固縮及心肌纖維扭曲；而在IR+PACAP38 組，上述急性損傷性組織病理改變得到明顯改善。

表1 PACAP38對H9C2心肌細(xì)胞輻照敏感性的影響（s）Tab 1 Effect of PACAP38 on radiosensitivity of H9C2 cells（±s）

表1 PACAP38對H9C2心肌細(xì)胞輻照敏感性的影響（s）Tab 1 Effect of PACAP38 on radiosensitivity of H9C2 cells（±s）

Group D0/Gy Dq/Gy SF2 SER Control PACAP38（10-9 mol·L-1）PACAP38（10-7 mol·L-1）1.59±0.01 1.67±0.03 1.76±0.06 1.27±0.07 1.70±0.06 1.99±0.11 0.53±0.02 0.63±0.01 0.70±0.02 1.00 0.95±0.02 0.91±0.03

圖3 PACAP38干預(yù)對輻照小鼠心肌組織的保護(hù)作用（H-E染色，×400）Fig 3 Protective effect of PACAP38 treatment on myocardial tissue after irradiation（H-E staining,×400）

3 討論

RIHD 的發(fā)生隨著隨訪時(shí)間的延長而增多，并且在一定程度上抵消胸部腫瘤放射治療的生存獲益。來自早期乳腺癌臨床試驗(yàn)協(xié)作組的一項(xiàng)meta 分析顯示，術(shù)后放射治療可使乳腺癌患者的15年乳腺癌死亡風(fēng)險(xiǎn)降低5%，但是發(fā)生致死性心血管事件的相對風(fēng)險(xiǎn)卻增加27%［5］。隨著現(xiàn)代放射治療技術(shù)的快速發(fā)展，心臟受照劑量和體積明顯下降，但是仍不能降至零；并且隨著乳腺癌大分割及肺癌立體定向放射治療的應(yīng)用，心臟受照的劑量體積模式發(fā)生了改變，呈現(xiàn)高劑量小體積及低劑量大體積共存的現(xiàn)象。只要有劑量就會有損傷，所以亟需發(fā)掘新的保護(hù)策略抵抗放射性心肌損傷。既往在探索RIHD的臨床治療藥物方面有過多次嘗試。例如氨磷汀，1995 年被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)為放射保護(hù)劑［10］；但是，由于其會引起嚴(yán)重的惡心、嘔吐及低血壓等不良反應(yīng)，并未在臨床常規(guī)應(yīng)用［11］。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑也被報(bào)道過，有望成為降低放射性心肺損傷的治療藥物；但是，緩激肽積累引起的血管性水腫、低血壓及干咳等不良反應(yīng)限制了其應(yīng)用［12］。因此，亟需發(fā)掘有效但無毒的藥物，預(yù)防和治療放射性心肌損傷。

PACAP 作為一種內(nèi)源性生物多肽，由于其在進(jìn)化過程中保持高度保守的結(jié)構(gòu)，被認(rèn)為是血管活性腸多肽超家族的祖先分子［7］。PACAP 包括2 種生物活性形式，即PACAP38 和PACAP27（分別包括38 或27 個(gè)氨基酸），而PACAP38 約占總數(shù)的90%。PACAP38 是一種天然多效生物活性肽，在缺血缺氧后組織損傷的早期修復(fù)中起重要作用［13］。基于PACAP38 的抗炎、抗凋亡和抗氧化活性，PACAP38 被認(rèn)為具有重要的細(xì)胞保護(hù)作用。在心臟整體功能中，有研究［8］發(fā)現(xiàn)PACAP干預(yù)后具有正向肌力、正向變時(shí)及舒張血管等作用。在心肌細(xì)胞中，有研究［14］發(fā)現(xiàn)PACAP 干預(yù)后可顯著緩解蒽環(huán)類化學(xué)治療藥物誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激損傷。PACAP的作用通過3種G蛋白相關(guān)受體介導(dǎo)——血管活性腸肽受體1（vasoactive intestinal peptide receptor 1，VPAC1）、VPAC2 和垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽受體1 （pituitary adenylate cyclaseactivating polypeptide receptor 1，PAC1），其中PAC1 受體是PACAP 特異性受體。通過與受體結(jié)合進(jìn)一步觸發(fā)第二信使信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)，阻斷細(xì)胞色素C 的釋放，抑制Caspase 的活化［14］。PACAP 還可以激活PI3K/Akt 通路，進(jìn)而抑制Bax、c-Jun 等促凋亡因子的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗凋亡的細(xì)胞保護(hù)作用［15］。

在本研究中，首先構(gòu)建了體內(nèi)外心臟輻照模型，體外心肌細(xì)胞輻照劑量為12 Gy。參考相關(guān)文獻(xiàn)［16-17］中的數(shù)據(jù)，心肌細(xì)胞的輻照劑量梯度分布在0、2、4、8、10、12、16 Gy；當(dāng)輻照劑量為12 Gy 時(shí)，心肌細(xì)胞存在明顯的輻照損傷特征，并且損傷可被逆轉(zhuǎn)修復(fù)［16］。Lauk等［18］在體內(nèi)研究中發(fā)現(xiàn)，嚙齒動物在心臟輻照劑量為10 Gy及以上時(shí)表現(xiàn)出明顯的放射性心肌損傷的特征。嚙齒動物輻照劑量梯度分布在0、10、14、18、20 Gy［17，19-20］。本研究中，動物輻照劑量選擇14 Gy，后續(xù)研究將增加多個(gè)劑量梯度進(jìn)一步驗(yàn)證。通過體內(nèi)心臟輻照模型研究，發(fā)現(xiàn)PACAP38 可以有效修復(fù)小鼠心臟組織放射性病理損傷。通過體外細(xì)胞輻照模型，我們發(fā)現(xiàn)PACAP38 可以降低輻照誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞毒性，降低心肌細(xì)胞的輻照敏感性；但對于其作用機(jī)制是否與抑制細(xì)胞凋亡及氧化應(yīng)激損傷相關(guān)，尚需進(jìn)一步探究。研究結(jié)果將有助于開發(fā)新的治療策略，干預(yù)胸部腫瘤放射治療相關(guān)的心肌損傷。而且，有必要開展進(jìn)一步的動物實(shí)驗(yàn)，探究PACAP38 對放射性心肌損傷的長期作用，包括早期損傷與晚期損傷，加速臨床轉(zhuǎn)化的進(jìn)展。另外，RIHD 的發(fā)生涉及冠狀動脈、心包、心肌、瓣膜、傳導(dǎo)系統(tǒng)等多種心臟亞結(jié)構(gòu)。在本研究中，我們主要探究了PACAP38 對心臟的主要亞結(jié)構(gòu)——心肌的保護(hù)作用。PACAP38 對其他心臟亞結(jié)構(gòu)的保護(hù)作用及其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，PACAP38 在體內(nèi)外對急性放射性心肌損傷具有一定的預(yù)防作用，表現(xiàn)為降低心肌細(xì)胞的輻照敏感性及細(xì)胞毒性，逆轉(zhuǎn)輻照誘導(dǎo)的小鼠心肌組織病理損傷。PACAP38 在體內(nèi)外心臟輻照模型中展現(xiàn)出來的心肌細(xì)胞保護(hù)作用，為其成為RIHD 無毒、有效的保護(hù)策略提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。未來還需要深入開展轉(zhuǎn)化研究，評估其藥效學(xué)和治療效果。