徐 琦 朱張茜 劉澤政 朱建碧 劉靈川 丁歡歡 鄭 潔 金純純

關(guān)節(jié)滑膜增生是多種關(guān)節(jié)疾病的共同病理生理過程，尤其是在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)中，滑膜炎促進(jìn)免疫活性細(xì)胞釋放多種炎性細(xì)胞因子、蛋白水解酶、膠原酶等，對軟骨、韌帶、肌腱等關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)造成持續(xù)性的影響，并導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形[1]。RA的內(nèi)科治療主要使用改善病情藥物(disease-modifying antirheumatic drugs，DMARDs)，全身RA在DMARDs的控制下趨于穩(wěn)定，但局部仍活動的關(guān)節(jié)滑膜炎癥導(dǎo)致了全身的炎癥復(fù)發(fā)[2，3]。外科治療目前主要使用關(guān)節(jié)鏡下滑膜切除術(shù)，但該術(shù)式較難全面清除增生的滑膜組織[4]。超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮射頻消融術(shù)是一種有效滅活淺表局部腫瘤組織的微創(chuàng)治療方式，創(chuàng)傷小、恢復(fù)快，因此可試用于治療關(guān)節(jié)滑膜增生性疾病，該治療方法目前報道少，療效尚不清楚[5，6]。本研究使用經(jīng)皮射頻消融術(shù)治療AIA模型兔膝關(guān)節(jié)滑膜增生，并觀察了該術(shù)式的短期療效。

材料與方法

1.實驗動物：本研究所用的日本大耳白兔由溫州醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，共計40只3～6月齡雄性清潔級日本大耳白兔，體質(zhì)量為1.7～2.7kg。

2.分組：①RFA組：以AIA動物模型法進(jìn)行造模后，隨機選擇一側(cè)膝關(guān)節(jié)接受射頻消融術(shù)治療，共15只[7]；②非RFA組：以AIA動物模型法進(jìn)行造模后，不做治療干預(yù)，共15只；③對照組：以0.9%NaCl注射液局部注射作為對照，隨后不經(jīng)任何干預(yù)正常飼養(yǎng)，共10只。

3.試劑與器具：卵清白蛋白(OVA，美國Sigma公司)，弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，cDNA RT-PCR試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex Taq試劑盒(日本TaKaRa公司)。超聲造影劑使用SonoVue(意大利Braco公司)，加入5ml 0.9%NaCl注射液震蕩至均勻，造影時經(jīng)兔耳緣靜脈團(tuán)注0.1ml，隨后注射1ml 0.9%NaCl注射液；射頻消融儀器(美國Covidien公司)，射頻消融針型號為Cool-tip ACT1510，治療時按60W等額輸出功率。

4.超聲儀器與參數(shù)：采用GE LOGIQ E9型超聲診斷儀，使用ML6-15線陣探頭進(jìn)行灰階和能量多普勒超聲檢查，探頭頻率7.0MHz，PWr-15dB，機械指數(shù)(MI)0.35，使用配備超聲造影軟件的9L線陣探頭進(jìn)行超聲造影檢查，頻率GEN 7.0MHz，PWr-15dB，機械指數(shù)(MI)0.35，輸出能量10%。造影前調(diào)節(jié)增益至適當(dāng)水平。

5.制作AIA關(guān)節(jié)炎模型步驟：基礎(chǔ)致敏：20mg/ml的OVA 0.9%NaCl注射液1ml在兔肩胛間區(qū)5個不同部位皮下注射，連續(xù)2周，每周1次，第3周使用10mg/ml OVA與弗氏完全佐劑1∶1乳劑1ml在兔肩胛間區(qū)5個不同部位皮下注射；膝關(guān)節(jié)注射：第5周使用10mg/ml的OVA乳劑各1ml注射在兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)髕韌帶兩側(cè)。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：膝關(guān)節(jié)紅、腫、熱、關(guān)節(jié)僵硬、活動受限；超聲顯示雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜增生厚度均至少達(dá)到4mm。

6.滑膜射頻消融術(shù)操作過程：以2%戊巴比妥鈉1.5ml/kg兔耳緣靜脈麻醉，剃毛、消毒后進(jìn)行滑膜超聲造影，觀察滑膜增強情況。多點連續(xù)移動消融法(moving shot)逐步消融滑膜組織，軟骨、重要肌腱旁滑膜組織以“杠桿撬離法”做為應(yīng)對，完成后即刻再次超聲造影，觀察有無殘留活性的滑膜組織及是否存在周圍軟組織的誤消融區(qū)，如有殘存活性滑膜區(qū)域，重復(fù)射頻消融至消融完全[8，9]。由固定人員射頻消融術(shù)擔(dān)任消融手術(shù)者及助手。

7.術(shù)后處理與評價：RFA術(shù)后消融處冰敷2h，前3天予16萬單位/毫升青霉素2.5ml肌內(nèi)注射預(yù)防感染。術(shù)后第1、3、7、14天進(jìn)行術(shù)后觀察，測量兔體質(zhì)量、膝關(guān)節(jié)徑、超聲評價滑膜最大厚度、滑膜炎評分，滑膜炎按0～3分法進(jìn)行半定量評分[10]。第14天處死動物，髕旁內(nèi)外并橫斷韌帶聯(lián)合切口解剖膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察雙膝關(guān)節(jié)滑膜、軟組織損傷黏連、軟骨與骨侵蝕情況。按Okura等[11]法取下髕下脂肪墊組織，在30000×g下離心20min，采用TRIspin法從髕下脂肪墊組織中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA RT-PCR，測定兔TNF-α、VEGF mRNA，引物序列參照Reno等[12]的研究。根據(jù)Zagariya等[13]的方法Western blot法檢測蛋白質(zhì)提取物中的TNF-α、VEGF水平。

結(jié) 果

1.AIA動物模型建立情況：3組共40只日本大耳白兔體質(zhì)量為1.73～2.68kg，平均體質(zhì)量為2.22±0.24kg，3組間體質(zhì)量單因素方差分析結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.437，P>0.05)。所有動物在造模與飼養(yǎng)過程中無死亡情況，其中26只一次性造模達(dá)到造模標(biāo)準(zhǔn)，其余4只在膝關(guān)節(jié)補注射1次OVA與弗氏完全佐劑1∶1乳劑1周后達(dá)到成模標(biāo)準(zhǔn)。

2.射頻消融術(shù)與術(shù)后情況：15只RFA組兔耳緣靜脈麻醉順利，麻醉后對RFA組進(jìn)行術(shù)前超聲檢查及CEUS(圖1)，滑膜組織CEUS動脈期滑膜組織與周邊肌肉組織對比呈高增強、均勻增強(12/15，80%)，少數(shù)兔滑膜組織CEUS呈等增強、不均勻增強(3/15，20%)，實質(zhì)期滑膜組織緩慢消退。周邊積液區(qū)域呈始終無增強的充盈缺損區(qū)。在超聲引導(dǎo)下采用逐步法對滑膜組織進(jìn)行射頻消融并以CEUS作為評價標(biāo)準(zhǔn)(圖1C～F)，11例一次性消融完全(73.33%)，其余4例在第2次消融后CEUS提示為消融完全(圖1F)。15例RFA組兔術(shù)中未出現(xiàn)與手術(shù)相關(guān)的死亡現(xiàn)象。

3.RFA術(shù)后短期療效觀察：RFA組兔治療一側(cè)膝關(guān)節(jié)術(shù)后3天內(nèi)出現(xiàn)較明顯的腫脹情況(圖2A)。3組兔體質(zhì)量變化及膝關(guān)節(jié)周徑變化對比詳見圖3。同飼養(yǎng)周期時RFA組、非RFA組體質(zhì)量低于對照組，RFA組兔在滑膜消融術(shù)后體質(zhì)量平穩(wěn)；術(shù)前同飼養(yǎng)周期RFA、非RFA 兩組關(guān)節(jié)周徑均大于同期對照組(P均<0.01)，RFA組在消融術(shù)后第3天關(guān)節(jié)周徑達(dá)到最大值，隨后逐漸減低，在術(shù)后第3、第7天RFA組與非RFA組、對照組比較，關(guān)節(jié)周徑差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，在第14天測量時與非RFA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖3 RFA組兔RFA術(shù)后與其他兩組兔體質(zhì)量與膝關(guān)節(jié)周徑隨時間變化曲線圖

非RFA組滑膜厚度與滑膜炎評分隨時間無顯著變化(P均<0.01)，而RFA組在消融術(shù)后滑膜厚度減低，與非RFA組比較,術(shù)后第7、14天比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01，圖4A)?；ぱ自u分在術(shù)后顯著減低，與非RFA組比較,術(shù)后第3、7天時差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01,圖4B)，術(shù)后第14天兩組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖4 RFA組與非RFA組兔膝關(guān)節(jié)超聲測定滑膜厚度與滑膜炎半定量評分隨時間變化曲線圖

同期飼養(yǎng)的白兔在相當(dāng)于RFA組術(shù)后第14天時處死，3組間髕下脂肪墊測定TNF-α、VEGF mRNA比較詳見表1和圖5。RFA組兔關(guān)節(jié)TNF-α、VEGF mRNA表達(dá)水平與非RFA組、對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)；非RFA組與對照組以上3種細(xì)胞因子水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)。RFA組術(shù)后TNF-α、VEGF水平呈現(xiàn)下降趨勢，但仍高于對照組。

表1 兔髕下脂肪墊組織總RNA測定TNF-α、VEGF mRNA的3組間比較

圖5 兔髕下脂肪墊測定TNF-α、VEGF mRNA表達(dá)3組間比較

討 論

關(guān)節(jié)滑膜增生常見于多種關(guān)節(jié)疾病，在RA中滑膜增生促進(jìn)了炎性細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生，導(dǎo)致關(guān)節(jié)喪失功能[1]。隨著超聲引導(dǎo)下熱消融治療的不斷成熟與進(jìn)步，超聲引導(dǎo)下滑膜射頻消融術(shù)也成為了一種潛在的有效治療手段，本研究利用AIA模型模擬RA滑膜增生病理生理過程，使用RFA術(shù)對滑膜組織進(jìn)行治療，并觀察其短期療效。

AIA模型成模穩(wěn)定，本研究中RFA組與非RFA組30只日本大耳白兔均造模成功[7]。在對同飼養(yǎng)周期3組實驗動物體質(zhì)量及關(guān)節(jié)徑觀察表明(圖3)，RFA組兔術(shù)后體質(zhì)量平穩(wěn)，未出現(xiàn)顯著的由于滑膜消融帶來的進(jìn)食方面的影響，主要的術(shù)后影響出現(xiàn)在膝關(guān)節(jié)腫脹方面，在術(shù)后第3天，RFA組兔膝關(guān)節(jié)周徑達(dá)到峰值，與其他兩組兔比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，隨后關(guān)節(jié)腫脹情況逐漸恢復(fù)，至術(shù)后第14天，RFA組兔膝關(guān)節(jié)周徑與非RFA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，并且觀察到在術(shù)后第14天時，兔膝關(guān)節(jié)活動情況已基本恢復(fù)至術(shù)前水平。因此可以認(rèn)為在膝關(guān)節(jié)滑膜RFA術(shù)對機體的影響是短暫的、可以恢復(fù)的。該種表現(xiàn)類似于在人體其他淺表部位腫瘤行RFA治療時的表現(xiàn)[5，6]。

在滑膜RFA術(shù)療效觀察方面，術(shù)后超聲定期觀察評價表明RFA組術(shù)后滑膜厚度隨時間的延長而減低，并在術(shù)后第7、14天時其與非RFA組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。而滑膜炎評分在術(shù)后顯著減低，在術(shù)后14天內(nèi)未出現(xiàn)復(fù)發(fā)，可以認(rèn)為RFA術(shù)在短期內(nèi)對于滑膜增生的滅活效果是值得肯定的。而非RFA組在飼養(yǎng)至相當(dāng)于RFA組術(shù)后第2周末時開始出現(xiàn)滑膜炎評分的自發(fā)降低表現(xiàn)，提示AIA模型滑膜炎可能出現(xiàn)了自愈現(xiàn)象。

RFA術(shù)對于關(guān)節(jié)內(nèi)的炎性微環(huán)境影響方面，髕下脂肪墊TNF-α、VEGF mRNA表達(dá)水平(表1，圖5)。表明RFA組關(guān)節(jié)TNF-α、VEGF mRNA水平與非RFA組同期比較呈下降趨勢(P均<0.05)，但仍高于對照組(P均<0.01)。雖然RA是一種病因不明的慢性全身炎性疾病，但TNF-α已被證明在RA及其他多種自身免疫性疾病的發(fā)病機制中起著核心作用[14]。TNF-α刺激滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的增殖和軟骨細(xì)胞破壞，并誘導(dǎo)其他促炎性細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[15，16]。而在本研究中RFA術(shù)抑制了TNF-α、VEGF的表達(dá)，是一種有潛力抑制關(guān)節(jié)滑膜增生與關(guān)節(jié)破壞的治療手段。

有研究表明，RFA術(shù)在治療原發(fā)性肝細(xì)胞癌時，RFA誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)使大量T細(xì)胞浸潤到腫瘤中，增強了CC趨化因子配體3的活性作用，并通過增強增強宿主免疫反應(yīng)起到抗腫瘤的作用[17，18]。另有研究顯示，RFA術(shù)比手術(shù)切除能夠更好地誘導(dǎo)并增強宿主免疫反應(yīng)[19]。本研究結(jié)果表明，滑膜射頻消融術(shù)似乎可以通過免疫調(diào)節(jié)的方式抑制關(guān)節(jié)炎的程度，但是通過本研究尚不能說明其機制如何，滑膜RFA術(shù)是否也誘導(dǎo)了關(guān)節(jié)內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)尚不得而知，或者僅是因為滅活的滑膜組織限制了關(guān)節(jié)內(nèi)的炎性細(xì)胞因子表達(dá)，值得進(jìn)一步探討。

超聲引導(dǎo)下膝關(guān)節(jié)滑膜射頻消融術(shù)是一種潛在的能夠治療關(guān)節(jié)滑膜增生的微創(chuàng)治療手段，在AIA兔動物模型實驗研究中治療效果良好，治療后能夠有效地清除有活性的滑膜組織，并且在動物實驗中關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞因子TNF-α、VEGF的表達(dá)得到了有效的抑制，但本研究的樣本量較少，且尚不明確炎性細(xì)胞因子表達(dá)抑制的病理生理機制。