楊 帆，胡章薇，姚 強

（青海大學農(nóng)林科學院/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西寧作物有害生物科學觀測實驗站，青海西寧810016）

青稞（Hordeum vulgare）為禾本科大麥屬，是大麥的一種特殊類型，又名裸大麥，因其具有較強的耐寒性，多分布在青藏高原高海拔的農(nóng)業(yè)區(qū)。種傳病害是影響青稞安全生產(chǎn)的重要因素之一，其中由大麥堅黑粉菌（Ustilago hordei）引起的堅黑穗病為害較為嚴重。大麥堅黑粉菌的休眠菌絲體和冬孢子附著在種子表面，次年播種后分別以休眠菌絲體蔓延到芽鞘上，或冬孢子萌發(fā)形成侵染絲自幼苗胚芽鞘侵入為害[1]。受侵染植株田間顯癥前與健康植株無異，顯癥后再進行防治意義不大。凌立等于1940 年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大麥堅黑穗病的田間發(fā)病率一般在10%左右，最高可達60%[1]。利用內(nèi)吸性種子處理殺菌劑進行播前種子處理可有效控制該病害[2]。雖然21 世紀堅黑穗病的發(fā)生率、危害程度均遠不及20 世紀，但現(xiàn)生產(chǎn)上每年仍有發(fā)生，若不采取有效措施，病原菌隨種子傳播侵染，病害發(fā)生則會逐年加重[3]。在生產(chǎn)上，僅為了防控該病害就進行種子殺菌處理，具有一定的盲目性，同時造成一定的化學藥劑殘留和環(huán)境污染。因此，建立快速檢測技術至關重要。

本研究應用的環(huán)介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是Notomi 等于2000年報道的一種能夠特異、高效、快速地擴增靶基因的新型核酸擴增技術[4]。該技術在1 h 左右即可完成擴增，其靈敏度是普通PCR 的100 倍[4]。結果可通過電泳儀[5]、real-time PCR 儀[5]及濁度儀[6]進行檢測，還可通過SYBR Green Ⅰ[7]、鈣黃綠素[8]、羥基奈酚藍[9]染色后用肉眼識別。目前，這種分子檢測技術已廣泛應用于真菌[10]、細菌、病毒[11]等方面。鑒于LAMP檢測過程操作簡單，反應時間短，結果易于判斷，我們基于初步建立的黑穗病快速LAMP 檢測體系，通過優(yōu)化種子洗滌沉淀物總DNA 的提取方法[12]，以期建立完善的青稞堅黑粉菌快速檢測技術體系，通過掌握種子的帶菌程度，進行精準施策，為青稞綠色生產(chǎn)提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料、試劑與儀器

試驗材料：青稞種子（北青1 號、北青2 號、北青3 號、北青6 號、北青8 號、昆侖14 號、昆侖15 號以及柴青1 號）及試驗供試菌株大麥堅黑粉菌（Ustilago hordei）、裸黑粉菌（Ustilago nuda）、禾生指葡孢霉（Dactylobotrys graminicola）、麥類核腔菌（Pyrenophora graminea）、大麥網(wǎng)斑菌（Pyrenophora teres）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum），均由青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室提供。

試驗試劑：Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR、dNTP Mixture、Loading Buffer，購自TaKaRa 公司；吐溫-20，購自索萊寶公司；Bst 2.0 WarmStart DNA Polymerase（10 Isothermal Amplification Buffer、MgSO4、Bst DNA 聚合酶），購自美國NEB 公司；氫氧化鈉，購自四川西隴科學有限公司。

主要儀器：DK-600A 電熱恒溫水槽，購自上海一恒科學儀器有限公司；TD5A 臺式低速離心機，購自湖南赫西儀器裝備有限公司；Centrifuge 5418R高速冷凍離心機，購自德國Eppendorf 公司；ABI 7500 實時熒光定量儀，購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 人工模擬種子帶菌。取大麥堅黑穗菌菌纓1粒（約150 mg）混于2 mL 水中，分別取其1/10、1/100、1/1 000 菌懸液混入1.800、1.980、1.998 mL 水中；裸黑粉菌取冬孢子粉150 mg；其他對照病原菌，在室內(nèi)培養(yǎng)基培養(yǎng)至滿皿后，加入無菌水制備菌懸液。最后將其分別倒入50 g 種子中，加200 mL 水、吐溫-20 1 mL，振蕩5 min，洗滌液3 000 r/min 離心10 min，去上清后備用。

1.2.2 裂解液快速提取DNA。1）將“1.2.1”節(jié)中制備的人工模擬樣品加入1 mL 濃度為3 mol/L 的NaOH溶液，65 ℃水浴30 min。取出離心管，加1 mol/L HCl中和，10 000 r/min 離心1 min，棄上清，加無菌水沖洗樣品，至pH 值為7～8。2）用牙簽分別挑取少量種子洗滌沉淀物，置于潔凈載玻片上摩擦，并不時在顯微鏡下觀察。待冬孢子破裂后取20 μL 裂解液于載玻片上與待測樣品混合，轉(zhuǎn)至離心管內(nèi)，裂解液補足至50 μL，80 ℃水浴裂解15 min，短暫離心后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-LAMP 檢測青稞種子中大麥堅黑粉菌。以冬孢子粉添加量為1 粒、1/10 粒、1/100 粒、1/1 000粒和加有裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麥類核腔菌、大麥網(wǎng)斑菌以及禾谷鐮孢菌的種子洗滌沉淀樣品提取的DNA 為檢測樣本，以ddH2O 為陰性對照，進行RT-LAMP 檢測，并在檢測結束加入SYBR GreenⅠ（10 000×）0.5 μL。供試引物為利用ITS（internal transcribed spacer）基因序列通過在線軟件Primer ExploreV5（http:// primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）設計，詳見表1。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。檢測體系為25 μL，各組分含量如表2 所示。65 ℃反應1 h，每1 min 讀取熒光，反應結束后加0.5 μL SYBR Green Ⅰ。根據(jù)實時熒光擴增（曲線若為“S”型則為陽性，呈1 條直線則為陰性）和SYBR Green Ⅰ顯色法（顯示綠色為陽性，橙色則為陰性）為判定依據(jù)。

表1 LAMP 引物

表2 RT-LAMP 與可視化LAMP 檢測體系

（續(xù)表）

1.2.4 青稞堅黑穗病LAMP 可視化檢測技術驗證。隨機抽選實驗室保存的8 個不同品種的青稞種子各50 g，加200 mL 水、吐溫-20 1 mL，振蕩5 min，洗滌液3 000 r/min 離心10 min，提取DNA，方法同“1.2.2”節(jié)。獲得種皮洗滌沉淀物的總基因組DNA后作為模板，ddH2O 為陰性對照，進行LAMP 可視化檢測。檢測體系中各成分含量如表2，反應前加SYBR GreenⅠ（10 000×）于PCR 管蓋內(nèi)，反應結束后，瞬時離心觀察顯色情況，若為綠色則為陽性，橙色則為陰性。

2 結果與分析

2.1 冬孢子破裂

大麥堅黑粉菌與裸黑粉菌成熟的單個黑粉菌冬孢子具有內(nèi)壁和外壁，外壁厚且堅硬，嚴重阻礙冬孢子DNA 的提取。本研究參考并改進了一年四季提取小麥矮腥黑穗菌冬孢子的方法[9]，用3 mol/L的NaOH 溶液水浴種子洗滌沉淀物，65 ℃、30 min后取適量在潔凈載玻片上來回摩擦，并不時放于顯微鏡下觀察，如圖1-B 時即可進行DNA 提取。由于大麥堅黑粉菌冬孢子為（5～9）μm×（6～7）μm，相比于直徑為5～9 μm 的裸黑粉菌冬孢子體積至少大1 倍，因此用載玻片來回摩擦十多下，可使大麥堅黑粉菌冬孢子破裂，而裸黑粉菌冬孢子外壁卻不受影響。

圖1 破壁前（A）、后（B）的大麥堅黑粉菌冬孢子

2.2 RT-LAMP 檢測青稞種子中大麥堅黑粉菌

人工模擬種子帶菌樣品的實時熒光擴增曲線（圖2-A）和SYBR Green Ⅰ顯色（圖2-B）結果均顯示，僅4 種不同冬孢子數(shù)量的種子洗滌沉淀樣品為陽性，其他為陰性。表明所建立的青稞堅黑穗病快速檢測技術能夠特異性檢測出青稞的大麥堅黑粉菌。

圖2 人工模擬種子帶菌檢測

2.3 青稞堅黑穗快速檢測技術驗證

分別以隨機選取的50 g 青稞不同品種（北青1號、北青2 號、北青3 號、北青6 號、北青8 號、昆侖14 號、昆侖15 號以及柴青1 號）種子的洗滌沉淀物總DNA 為模板，進行LAMP 可視化檢測，結果如圖3 所示，北青3 號和昆侖15 號為綠色（陽性），其他為橙色（陰性），表明北青3 號和昆侖15 號2 個品種中攜帶大麥堅黑粉菌，建立的快速檢測體系可用于青稞播前檢測大麥堅黑粉菌。

圖3 青稞種子可視化LAMP 檢測

3 討論與結論

堅黑穗病是青稞生產(chǎn)中最為常見、發(fā)病較為廣泛的種傳病害之一。田間顯癥后只能通過拔出病株來降低種子帶菌率，這種方式耗時耗力。種子處理殺菌劑的應用可有效防治大麥堅黑粉菌對青稞的侵染。但是帶菌種子與健康種子表觀沒有差異，導致在實際生產(chǎn)中出現(xiàn)藥物濫用的現(xiàn)象，給環(huán)境和糧食安全帶來巨大壓力。因此，建立種子播前的快速檢測技術對生產(chǎn)具有重要的指導意義。然而，目前國內(nèi)外對大麥堅黑粉菌的研究多集中于病原- 寄主互作[13]、分子變異和遺傳結構分析[14]以及侵染機制等方面[15]，在快速檢測方面成果甚少。20 世紀對于此病害檢測方面的研究主要集中于傳統(tǒng)檢測，包括顯微鏡直接觀察法、種皮攜帶物洗滌離心后顯微觀察法以及冷凍吸水紙法等[16]。

本研究為建立完善的青稞堅黑粉菌檢測技術，基于初步建立的LAMP 檢測體系，經(jīng)裂解液快速提取法提取種子表皮攜帶物的總DNA 后，進行LAMP（環(huán)介導等溫擴增技術）檢測并驗證。結果表明，裂解液快速提取法提取種皮洗滌沉淀物總基因組DNA，僅混有大麥堅黑粉菌的種子洗滌沉淀物實時熒光和SYBR GreenⅠ可視化LAMP 檢測均為陽性，其他病原菌（大麥堅黑粉菌、裸黑粉菌、禾生指葡孢霉、麥類核腔菌、大麥網(wǎng)斑菌、禾谷鐮孢菌）2 種檢測均為陰性。最后，通過對實際青稞種子進行檢測，在8 個不同品種中檢測出北青3 號和昆侖15 種子攜帶有大麥堅黑粉菌。

雖然目前僅有的大麥堅黑粉菌與裸黑粉菌分子生物學信息均不能區(qū)分兩者，未能設計出特異性引物，但是本研究基于2 種黑粉菌在種子上帶菌方式和冬孢子的體積大小的不同，成功建立出可特異性檢測青稞種子中大麥堅黑粉菌的技術體系。所建立的檢測技術可應用于生產(chǎn)，為防治青稞堅黑穗病提供科學的依據(jù)。