黃剛 王華富* 劉麗仙 桂志紅 朱美曉

畬藥，主要分布在浙江省景寧畬族自治縣以及福建、江西等省的部分山區(qū)，目前已發(fā)現(xiàn)畬藥在白血病等疾病有良好的療效，苦爹菜作為一味重要畬藥，在畬藥家族中有著巨大的貢獻(xiàn)，其為傘形科茴芹屬植物異葉茴芹Pimpinella diversifolia DC.的全草［1］。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究結(jié)果顯示畬藥苦爹菜研磨液可顯著提高脾淋巴細(xì)胞增殖能力及T 淋巴細(xì)胞亞群的水平，提高血清IL-2、IL-6 和TNF-α 分泌水平，本文在前期研究基礎(chǔ)上對(duì)畬藥苦爹菜的不同提取部位增強(qiáng)免疫力功能進(jìn)行研究，以期為苦爹菜生物活性成分的研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康的雄性昆明系小白鼠，為SPF 級(jí)，年齡6～8 周，體重20～24 g，購置于湖北省疾病預(yù)防控制中心，飼養(yǎng)于武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司［實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（鄂）2018-0104］，小鼠在20～28℃條件下用標(biāo)準(zhǔn)鼠料及蒸餾水進(jìn)行飼養(yǎng)。鼠籠清潔1～2 次/周。鼠籠用84 消毒液進(jìn)行常規(guī)消毒?？刂骑曫B(yǎng)房室溫在（24±26）℃，相對(duì)濕度40%～70%，音響＜60 dB，明暗周期12 h，24 h 通風(fēng)換氣。

1.2 試劑和儀器 苦爹菜，18 kg，由浙江省麗水市藥檢所李水福主任中藥師/教授鑒定，采自浙江省景寧畬族自治縣，自然陰干，經(jīng)剪碎后用95%乙醇加熱回流提取3 次，2 h/次，過濾，回收溶劑，得321 g 總膏?？偢啻痔嵛锛舆m量水懸浮，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液濃縮成浸膏得石油醚部位48 g，乙酸乙酯部位38 g，正丁醇部位85 g，水部位159 g。總膏及各極性部位均勻溶解或懸浮于蒸餾水，均配制成折合生藥材濃度約為1 g/ml 的溶液備用。環(huán)磷酰胺（100 mg），上海麥克林科技有限公司（批號(hào)：C10176816）；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒［江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司（批號(hào)：20180419）］；乳酸脫氫酶細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒［碧云天生物技術(shù)有限公司（批號(hào)：C0016）］；Elisa 試劑盒（南京建成生物優(yōu)先公司），CD3-FITC、CD4-PI、CD8-PerCP；單抗（美國(guó)BioLegend 公司），酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)為Multuskan Go 1510），顯微鏡（Olympusix71，德國(guó)徠卡公司），流式細(xì)胞儀（FASCC，美國(guó)BD 公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 （1）造模：選取健康的SPF 級(jí)小鼠100只，其中8 只為正常組，92 只經(jīng)腹腔注射35%乙醇溶解的環(huán)磷酰胺50 mg/kg 進(jìn)行造模，每隔1 天注射1 次，總共注射3 次，注射前用絡(luò)合碘進(jìn)行常規(guī)消毒，注射完畢后觀察小鼠的活動(dòng)情況及死亡情況。（2）模型評(píng)判：定期觀察小鼠的日常生活癥狀，當(dāng)模型組漸漸出現(xiàn)行動(dòng)遲緩、食欲不振、毛發(fā)松散且無光澤等癥狀時(shí)，可以判斷免疫缺陷動(dòng)物模型初步成功；并在末次注射2 天后處死模型組小鼠與正常組小鼠及模型組小鼠各10 只，檢測(cè)胸腺及脾臟臟器重量指數(shù)，外周血T 淋巴細(xì)胞亞群百分比。與正常組及溶液組比較，模型組T 淋巴細(xì)胞亞群比率下降，并且脾臟、胸腺臟器重量指數(shù)下降可以判斷免疫缺陷動(dòng)物模型成立。（3）分組和給藥：選取健康的SPF 級(jí)小鼠100 只，其中8 只為正常組，92 只經(jīng)腹腔注射35%乙醇溶解的環(huán)孢菌素A 25 mg/kg 進(jìn)行造模，每隔1 天注射1 次，總共注射3 次，并選取造模成功的48 只，隨機(jī)選取8 只設(shè)為模型組，剩余40 只將其按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為A（總浸膏組）、B（石油醚部位組）、C（乙酸乙酯部位組）、D（正丁醇部位組）、E（水部位組）五組，均給予折合生藥材2 g/kg 進(jìn)行灌胃，以上藥物均給藥14 d，模型組和正常組給予生理鹽水0.2 ml 只進(jìn)行灌胃，14 d 后分別檢測(cè)細(xì)胞免疫和體液免疫的相關(guān)指標(biāo)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo) （1）一般情況：觀察并記錄小鼠每天的飲水量、食量及體重，實(shí)驗(yàn)期間是否掉毛，被毛的光澤度，活動(dòng)度，靈敏度等一般情況。（2）脾臟、胸腺指數(shù)的計(jì)算：所有動(dòng)物均末次給藥后1 h 腹主動(dòng)脈取血，制備含藥血清，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，斷頸處死小鼠，無菌條件下分離脾臟、胸腺。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/小鼠的體重；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/小鼠體重。（3）脾臟提取淋巴細(xì)胞：無菌條件下得到的小鼠脾臟，剔除脂肪、結(jié)締組織后用無菌手術(shù)剪剪成小塊，然后研缽中研磨，加入3 ml 的0.9%氯化鈉溶液后過濾，將過濾液1500 r/min 離心5 min，加入3 倍體積的紅細(xì)胞裂解液后重新混懸，離心后棄上清液得到沉淀細(xì)胞，用PBS 重懸后調(diào)整細(xì)胞密度為2×106/ml。（4）MTT 法檢測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力：吸取100 μl 細(xì)胞懸液接種于96 孔板，每份樣品設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，前3 個(gè)孔分別加入50 μl ConA（終濃度為5 mg/L），后3 個(gè)孔為對(duì)照孔，每孔加入50 μl 的RPMI-1640 培養(yǎng)液。置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h，將5×MTT 用Dilution Buffer 稀釋成1×MTT，每孔加入50 μl 1×MTT，于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，使MTT 還原為甲臜。培養(yǎng)結(jié)束后，1500 r/min 離心5 min，吸出上清液，每孔加150 μl DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖10 min，在570 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)每孔的光密度。淋巴細(xì)胞增殖能力=試驗(yàn)孔OD570 值/對(duì)照孔OD570 均值。（5）吞噬功能測(cè)定：小鼠腹腔注入20%（V ∶V）生理鹽水配制雞紅細(xì)胞懸液1 ml。30 min 后，頸椎脫臼處死，經(jīng)腹腔注射生理鹽水2 ml，取腹腔洗液1 ml 涂片，置37 ℃恒溫30 min，然后漂洗，晾干，以1 ∶1 丙酮甲醇溶液固定，4%（V ∶V）Ciemsa-磷酸緩沖液染色3 min，光鏡下觀察。吞噬百分率（%）=（吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)）×100；吞噬指數(shù)=被吞噬雞紅細(xì)胞總數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)。（6）T淋巴細(xì)胞百分比比較：研磨脾臟，制成細(xì)胞懸液備用，用磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107個(gè)/ml。取100 μl 脾臟、胸腺細(xì)胞懸液，均加入FITC 標(biāo)記的小鼠CD4 抗體、PE 標(biāo)記的小鼠CD8 抗體，4℃避光孵育1 h，加入PBS 1 ml，1200 r/min（r=8 cm）離心5 min，重復(fù)1 次，用PBS 300 μl 重懸，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞百分率。（7）血清IL-2、Il-6 和TNF-α 水平：采用ELISA 法檢測(cè)小鼠血清IL-2、Il-6 和TNF-α 水平。具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 正常組小鼠被毛光亮，活動(dòng)靈活，大便棕黑色，干濕適度。模型組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后第3 天出現(xiàn)活動(dòng)減少，食量下降，扎堆明顯，喜抱團(tuán)，易驚，毛色黯淡，陰囊皺縮，炸毛、掉毛現(xiàn)象。給藥一周后，A、B、C、D、E 組小鼠食量均逐漸增加，活動(dòng)增多，扎堆減少，停止掉毛，毛色恢復(fù)柔順光亮。但A、C 組效果更明顯。

2.2 各組脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)比較 A、B、C、D、E各組給藥2 周后體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)均顯著高于模型組（P＜0.05），C 組給藥2 周后脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)及體質(zhì)量與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其余各組體質(zhì)量、脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)均顯著低于正常組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)比較（±s）

表1 各組脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.05

組別 n 體質(zhì)量 脾臟指數(shù)（mg/g） 胰腺指數(shù)（mg/g）A 30.55±1.05*# 2.24±0.15*# 4.52±0.24*#8 25.55±1.02*# 1.82±0.17*# 3.41±0.22*#C 8 32.25±1.14* 2.97±0.15* 5.86±0.25*D 8 25.02±1.11*# 1.78±0.20*# 3.09±0.27*#E 8 25.11±1.01*# 1.77±0.17*# 3.03±0.31*#正常組 8 33.55±1.02* 3.02±0.20* 5.96±0.28*模型組 8 22.84±1.12 1.47±0.14# 2.67±0.26#B

2.3 各組脾淋巴細(xì)胞增殖能力比較 見表2。

表2 各組脾淋巴細(xì)胞增殖能力比較（±s）

表2 各組脾淋巴細(xì)胞增殖能力比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.05

組別 n 脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)A 8 3.04±0.29*#B 2.88±0.20*#C 8 3.33±0.25*8 D 2.72±0.16*#E 8 2.71±0.17*#8正常組 10 3.32±0.25*模型組 10 2.06±0.21#

2.4 各組炎癥因子比較 見表3。

表3 各組炎癥因子比較（±s）

表3 各組炎癥因子比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.05

組別 n IL-2（pg/ml） IL-6（ng/ml） TNF-α（ng/ml）A 8 10.32±1.21*# 48.24±4.47*# 115.30±9.82*#B 8 9.03±0.88*# 43.54±4.05*# 106.38±14.68*#C 8 11.41±1.18* 51.74±3.57* 124.06±5.93*D 8 8.91±1.20*# 40.10±4.33*# 103.77±10.52*#E 8 8.56±1.35* 39.85±2.12*# 104.25±6.95*#正常組 8 11.62±1.46* 52.57±3.22*# 125.45±6.02*模型組 8 6.34±1.03# 30.04±3.87 78.28±5.39#

2.5 各組T 淋巴細(xì)胞百分比比較 見表4。

表4 各組T淋巴細(xì)胞百分比比較（±s）

表4 各組T淋巴細(xì)胞百分比比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.05

組別 n CD4+ CD8+ CD4+/ CD8+A 8 70.38±4.75*# 50.50±4.63*# 1.40±0.17*#B 8 61.50±3.38*# 46.00±2.27*# 1.34±0.12*#C 8 78.38±4.75*# 52.50±4.63*# 1.49±0.17*#D 8 60.63±3.78*# 46.13±2.42*# 1.32±0.14*#E 8 60.88±6.58*# 44.38±6.07*# 1.39±0.21*#正常組 8 87.20±7.38* 55.50±2.60* 1.57±0.29*#模型組 8 20.90±4.79# 23.10±7.21 0.92±0.25#

2.6 各組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的影響 見表5。

表5 各組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的影響（±s）

表5 各組對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.05

組別 n 吞噬率（%） 吞噬指數(shù)A 8 22.18±1.35*# 0.24±0.08*#B 8 20.51±1.21*# 0.22±0.07*#25.38±1.25* 0.29±0.13*D 8 21.13±1.08*# 0.23±0.10*#C 8 21.18±1.23*# 0.20±0.07*#正常組 8 27.20±1.31* 0.32±0.11*模型組 8 12.10±1.22# 0.11±0.08 E 8

3 討論

苦爹菜作為一味重要畬藥，以全草及根入藥。民間常將其搗爛敷在手腕上，可治瘧疾，水煎外洗可治皮膚瘙癢，外用可治毒蛇咬傷、跌打損傷等［2-3］。歷代名家對(duì)中醫(yī)學(xué)的瘟疫、溫病、溫毒、虛勞、疫毒的治療均建議增強(qiáng)免疫，以鞏固正氣，從而驅(qū)邪托毒，重建免疫功能。民間采用苦爹菜治療瘧疾及毒蛇咬傷，是否與增強(qiáng)人體免疫力有關(guān)，本研究的前期研究成果已經(jīng)證實(shí)此觀點(diǎn)。但目前尚無研究對(duì)苦爹菜增強(qiáng)人體免疫力的活性部位的篩選，更無對(duì)其化學(xué)成分的研究。艾滋?。℉IV）是一種常見的免疫力低下的疾病，目前從畬族藥物中已發(fā)現(xiàn)對(duì)抑制HIV 活性表現(xiàn)出良好勢(shì)頭的天然活性成分較多，類型上有多糖類、蛋白質(zhì)和肽類、生物堿類、香豆素類、黃酮類、木脂素類、酚酸類、醌類、萜類等［4］。比如從Geum japonicum（水楊梅，又叫龍須草）分離得到一個(gè)三萜烯酸，有抑制HIV 病毒蛋白酶的活性［5］。因此，本研究對(duì)苦爹菜增強(qiáng)人體免疫力的活性部位進(jìn)行篩選，以期找到先導(dǎo)化合物，將具有重要的臨床意義。

胸腺與脾臟的質(zhì)量與機(jī)體質(zhì)量的比值主要取決于胸腺與脾臟內(nèi)部淋巴細(xì)胞增殖分化的程度，故可在一定程度上反映機(jī)體免疫功能的強(qiáng)弱［6］。本資料結(jié)果顯示，畬藥苦爹菜總浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)均顯著高于模型組，且乙酸乙酯部位脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)與正常對(duì)照組相當(dāng)，說明畬藥苦爹菜總浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位均能提高免疫缺陷小鼠的脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)，以乙酸乙酯部位效果更好。淋巴細(xì)胞的增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過程的一個(gè)重要階段。淋巴細(xì)胞的增殖活化能力對(duì)機(jī)體的免疫具有正向調(diào)節(jié)作用［7］。

本資料結(jié)果顯示，畬藥苦爹菜總浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位的脾淋巴細(xì)胞增殖能力均較免疫缺陷小鼠的顯著增高，且乙酸乙酯部位脾淋巴細(xì)胞增殖能力與正常組相當(dāng)。CD4+T 細(xì)胞即為Th 細(xì)胞，按照分泌的細(xì)胞因子的不同可分為Th1和Th2 兩個(gè)亞群。Th1 細(xì)胞主要分泌IL-2 等細(xì)胞因子，可促進(jìn)CTL 細(xì)胞分化、成熟，從而影響細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。Th2 細(xì)胞主要分泌IL-6、TNF-α 等細(xì)胞因子，參與β 細(xì)胞的分化、成熟及抗體生成過程，可促進(jìn)由抗體介導(dǎo)的體液免疫反應(yīng)，機(jī)體功能處于正常狀態(tài)時(shí)，Th1 和Th2 細(xì)胞維持著動(dòng)態(tài)平衡，保持機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫功能正常進(jìn)行［8-11］。

本資料結(jié)果顯示，畬藥苦爹菜總浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位均能顯著升高IL-2、IL-6、TNF-α 炎癥因子水平，乙酸乙酯部位更好，但對(duì)于是否能通過恢復(fù)Th1/Th2 的平衡，從而達(dá)到調(diào)節(jié)免疫功能低下小鼠的免疫狀態(tài)，需要進(jìn)一步的研究。單核-巨噬細(xì)胞在調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞和免疫應(yīng)答上起著重要作用［12-13］，本資料結(jié)果顯示，畬藥苦爹菜總浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位均能顯著升高腹腔巨噬細(xì)胞雞紅細(xì)胞吞噬率及吞噬指數(shù)，乙酸乙酯部位更顯著。

綜上所述，苦爹菜總浸膏、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位和水部位均能顯著提高環(huán)磷酰胺構(gòu)建的免疫缺陷小鼠的脾臟指數(shù)和胰腺指數(shù)，提高脾淋巴細(xì)胞增殖能力及T 淋巴細(xì)胞亞群的水平，提高血清IL-2、IL-6 和TNF-α 分泌水平，但苦爹菜乙酸乙酯部位效果更好，后期可對(duì)乙酸乙酯部位的化學(xué)成分進(jìn)行系統(tǒng)研究，以期找到先導(dǎo)化合物。