易琳 劉新福* 金得芳 司馬李杰

據(jù)統(tǒng)計(jì)肺癌發(fā)病率和病死率居我國(guó)所有腫瘤首位，但其發(fā)病率仍未達(dá)到最高峰［1］。根據(jù)肺癌組織學(xué)類型分類，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占全部肺癌的85%，其中肺鱗狀細(xì)胞癌占NSCLC 的30%［2］。目前，對(duì)于肺鱗狀細(xì)胞癌的治療措施，以外科手術(shù)切除為主，對(duì)于不能手術(shù)的疾病只能采取細(xì)胞毒性化療和免疫治療。然而，相同的治療手段，患者預(yù)后和療效卻存在明顯差異。研究表明，在疾病進(jìn)展中，腫瘤細(xì)胞在空間和時(shí)間上均處于不斷變化的狀態(tài)［3］，導(dǎo)致其遺傳基因及功能的多樣性，使得治療效果出現(xiàn)差異。本文從蛋白的層面上討論不同肺鱗狀細(xì)胞癌組織中Ki-67 的表達(dá)情況及其預(yù)后的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016 年6 月至2018 年6 月在本院收治的59 例經(jīng)皮手術(shù)切除、肺穿刺活檢或經(jīng)支氣管鏡活檢確診的肺鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床資料進(jìn)行回顧性分析，隨訪0～48 個(gè)月，本研究獲得南華大學(xué)附屬邵陽(yáng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有患者均行病理檢查確診且病理標(biāo)本充足；（2）所有患者按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）TMN 分期；（3）規(guī)范接受治療，病史資料保存完整。（4）總生存期（overall survival，OS）定義為從實(shí)驗(yàn)入組開(kāi)始至因任何原因引起死亡的時(shí)間。采用門診隨訪、電話隨訪等方式，末次隨訪時(shí)間為2020 年6 月。

1.2 免疫組化染色方法 所有肺癌組織蠟塊均制成4 μm 厚切片2 張，一張用于HE 染色，其余1 張用于免疫組化檢測(cè)Ki-67 的表達(dá)水平。免疫組織化學(xué)方法步驟：石蠟組織標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑，滴加一抗，放置濕盒中室溫條件下孵育，滴加生物素標(biāo)記二抗，放置濕盒中室溫條件下孵育，滴加DAB 顯色劑，并在濕溫盒中室溫下反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，封片，拍照讀片。由2 位病理科高級(jí)職稱醫(yī)師在對(duì)臨床資料不知情的情況下，對(duì)標(biāo)本染色結(jié)果進(jìn)行判斷。

1.3 結(jié)果判定 Ki-67 判定標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒為Ki-67 陽(yáng)性細(xì)胞，根據(jù)目前免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)中普遍采用的百分比分類。陽(yáng)性細(xì)胞（細(xì)胞總數(shù)為200 個(gè)）＜60%定義為低表達(dá)，≥60%定義為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n表示，分析Ki-67 表達(dá)、臨床特征之前的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier 法進(jìn)行評(píng)估；多因素分析采用Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型進(jìn)行分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者的一般情況分析 排除隨訪丟失患者，本研究共納入59 例肺鱗狀細(xì)胞癌患者，其中男43 例，女16例；年齡45～80 歲，中位年齡65 歲；接受手術(shù)治療11例，接受同步放化療治療2 例，接受化療28 例，其它姑息治療方案18 例。截止最后一次隨訪，死亡33 例，其它26 例為截尾。

2.2 肺鱗狀細(xì)胞癌組織中Ki-67 的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 見(jiàn)表1。

表1 肺鱗狀細(xì)胞癌組織中Ki-67表達(dá)情況與臨床特征的關(guān)系（n）

圖1 Ki-67的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

圖2 兩組患者2年生存率比較

2.3 肺鱗狀細(xì)胞癌組織中Ki-67 的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 如圖1 所示，59 例肺鱗狀細(xì)胞癌患者中，Ki-67高表達(dá)組與Ki-67 低表達(dá)組的生存曲線整體Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果為P=0.007（P＜0.001），表明Ki-67 高表達(dá)與預(yù)后不良有關(guān)。

2.4 Ki-67 在肺鱗狀細(xì)胞癌組織的表達(dá)對(duì)生存率的影響 如圖2 所示，Ki-67 低表達(dá)組的2 年生存率比Ki-67高表達(dá)組提高了41%，表明ki67 表達(dá)情況與鱗狀細(xì)胞肺癌預(yù)后密切相關(guān)。

2.5 單因素和多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)比例模型分析 如表2所示，單因素分析結(jié)果顯示，吸煙、TMN 分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、Ki-67 表達(dá)與2 年總生存期有相關(guān)性。性別、年齡、組織學(xué)分級(jí)與2 年總生存期無(wú)相關(guān)。將上述單因素變量全部納入Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析，結(jié)果顯示Ki-67 表達(dá)情況對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌生存時(shí)間有影響，高表達(dá)的死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)的3.265 倍，95%CI 為1.709～7.765，P=0.001。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)轉(zhuǎn)移的4.751 倍，95%CI 為1.808～12.480，P=0.002。有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者死亡風(fēng)險(xiǎn)是無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的3.060 倍，95%CI 為1.171～4.963，P=0.01。調(diào)整其它因素影響后表明，組織學(xué)分級(jí)亦是肺鱗狀細(xì)胞癌患者的獨(dú)立因素，OR=2.257，95% CI 為1.040～4.899，P=0.040。

表2 影響2年OS的單因素和多因素分析

3 討論

近年，以EGFR、ALK 靶點(diǎn)為代表的靶向藥物在非小細(xì)胞肺癌治療中取得巨大進(jìn)展，為驅(qū)動(dòng)基因陽(yáng)性的非小細(xì)胞肺癌患者帶來(lái)了巨大的生存獲益［4-5］。肺鱗狀細(xì)胞癌占非小細(xì)胞肺癌的30%，但肺腺癌的高頻突變基因在肺鱗狀細(xì)胞癌內(nèi)并不常見(jiàn)。盡管目前有大量的臨床研究，但在肺鱗狀細(xì)胞癌的治療手段仍有限。早期肺鱗狀細(xì)胞癌多無(wú)明顯臨床癥狀，大多數(shù)患者在確診時(shí)已屬晚期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)［6］。驅(qū)動(dòng)基因陰性的不可手術(shù)肺鱗狀細(xì)胞癌患者目前主要依靠化療，但是部分肺鱗狀細(xì)胞患者因不能接受化療帶來(lái)的副反應(yīng)而放棄治療。因此，尋找影響肺鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生機(jī)制及預(yù)后相關(guān)因素用于評(píng)估患者預(yù)后、指導(dǎo)臨床治療、開(kāi)發(fā)新治療藥物十分重要。

癌細(xì)胞增殖是影響癌癥發(fā)展的關(guān)鍵，用于評(píng)判癌細(xì)胞增殖的標(biāo)記物較多，Ki-67 是目前較為肯定的核增殖標(biāo)志物。Ki-67 是細(xì)胞核內(nèi)分裂增殖相關(guān)蛋白［7］，由MKI-67 基因編碼，其表達(dá)在所有活動(dòng)的細(xì)胞周期（G1、S、G2 和有絲分裂期），而在G0 期不表達(dá)。臨床研究表明Ki-67 增殖指數(shù)高低與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后密切相關(guān)［8］。本研究數(shù)據(jù)顯示，Ki-67 的表達(dá)與患者的組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TMN 分期有關(guān)，與文獻(xiàn)數(shù)據(jù)相符。有文獻(xiàn)［9］研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Ki-67 指數(shù)＞60%時(shí)，病情發(fā)展迅速，惡性程度高，生存期短。因此，本研究將Ki-67 指數(shù)是否≥60%作為研究臨界值進(jìn)行分組。本研究中59 例肺鱗狀細(xì)胞癌患者中，Ki-67 高表達(dá)患者的2 年總生存期明顯長(zhǎng)于Ki-67 低表達(dá)患者。Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸模型多因素分析Ki-67 高表達(dá)組的死亡風(fēng)險(xiǎn)是低表達(dá)的3.265 倍，95%CI 為1.709～7.765，P=0.001，與文獻(xiàn)結(jié)果大致符合。結(jié)果說(shuō)明Ki-67 表達(dá)情況對(duì)肺鱗狀細(xì)胞癌生存時(shí)間有影響。另外，本研究發(fā)現(xiàn)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)器官轉(zhuǎn)移、組織學(xué)分級(jí)亦是肺鱗狀細(xì)胞癌患者的獨(dú)立因素。

2011 年St.Gallen 共識(shí)確定Ki-67 作為分子分型的重要標(biāo)準(zhǔn)，建議Ki-67 高表達(dá)乳腺癌患者在內(nèi)分泌基礎(chǔ)上加化療，但不能預(yù)測(cè)療效。Ki-67 表達(dá)高低與肺鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后密切相關(guān)，但目前臨床尚無(wú)明確的指南及共識(shí)指導(dǎo)Ki-67 高表達(dá)的肺鱗狀細(xì)胞肺癌患者治療。

綜上所述，Ki-67 表達(dá)情況與肺鱗狀細(xì)胞癌的預(yù)后具有一定的關(guān)系。由于本研究為回顧性分析，可能存在信息不全面、偏倚等缺點(diǎn)，有必要進(jìn)一步開(kāi)展大宗病例研究，為預(yù)后評(píng)估及治療提供幫助。