章建偉 張濤 吳滿武

中樞性性早熟（central precocious puberty，CPP）由于下丘腦-垂體-性腺軸（hypothalamus pituitary-gonad axis，HPGA）過早啟動(dòng)，發(fā)育年齡提前，骨骺提前閉合，將影響患兒的最終成年身高，給家長(zhǎng)和患兒帶來嚴(yán)重的心理影響和社會(huì)影響［1］。促性腺激素釋放激素類似物（gonadotrophin releasing hormone analogue，GnRHa）能有效抑制HPGA 軸的活動(dòng)、減緩骨齡進(jìn)展、改善最終成年身高［2］。然而，臨床上有相當(dāng)部分患兒應(yīng)用GnRHa治療后出現(xiàn)生長(zhǎng)減速，甚至生長(zhǎng)停滯，最終成年期身高改善不理想［3-4］。目前臨床上部分醫(yī)生采用GnRHa 和重組人生長(zhǎng)激素（Recombinant Human Growth Hormone，rhGH）聯(lián)用治療CPP 克服生長(zhǎng)減速，但其確切機(jī)制尚未闡明［5-6］。本研究利用生長(zhǎng)激素治療GnRHag 干預(yù)后性早熟大鼠，觀察軟骨生長(zhǎng)板變化，來探究聯(lián)合應(yīng)用rhGH 和GnRHa 治療中樞性性早熟生長(zhǎng)減速的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及模型建立 48 只5 日齡的SFP 級(jí)雌性SD 大鼠由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心大小鼠繁殖飼料（批號(hào)P1100-20200511006）飼養(yǎng)。隨機(jī)分為8 組，每組各6 只。A：正常大鼠對(duì)照組，B：性早熟大鼠模型組，C：GnRHa 1000 μg/kg，D：GnRHa 800 μg/kg 給藥組，E：GnRHa 600 μg/kg 給藥組，F(xiàn)：rhGH+GnRHa 600 μg/kg 給藥組，G：rhGH+GnRHa 800 μg/kg，H：rhGH+GnRHa 1000 μg/kg 給藥組。模型組與給藥組大鼠于5 日齡時(shí)皮下注射300 μg 達(dá)那唑溶液，溶解于25 μl 乙二醇/乙醇（1 ∶1）混合液。出生后25 天開始每天檢查陰道開口情況，直至大鼠建立正常的性周期。給藥組大鼠分別給予GnRHa 制劑曲普瑞林，2 周強(qiáng)化治療1 次，4 周末時(shí)對(duì)聯(lián)合給藥組（FGH 組）大鼠加用rhGH 制劑［1 IU/（kg·d）］，8 周末時(shí)結(jié)束。

1.2 檢測(cè)指標(biāo) （1）體征觀察：自造模起每周用游標(biāo)卡尺測(cè)量一次大鼠的體重、鼻尾長(zhǎng)、脛骨長(zhǎng)，連續(xù)8 周。大鼠脛骨組織切片觀察大鼠脛骨樣本置入4%多聚甲醛溶液中，24 h 后鋸取0.5 cm 骨片，經(jīng)過脫鈣，脫水、石蠟包埋、冷凍切片，制成4 μm 石蠟切片，用于HE染色，通過顯微鏡拍照，觀察和分析樣本。（3）IGFR1、FGF2 和FGFR3 蛋白表達(dá)量檢測(cè)：采用Western Blot 的方法半定量檢測(cè)蛋白表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間兩兩比較，方差齊性者采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊者采用Kruskal-Wallis H 檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體重、鼻尾長(zhǎng)和脛骨長(zhǎng)測(cè)量 根據(jù)表1 可得，給藥8 周后，rhGH+GnRHa 1000 μg/kg 與rhGH+GnRHa 800 μg/kg 大鼠的體重、鼻尾長(zhǎng)度和脛骨長(zhǎng)度均顯著上升（P＜0.01），GnRHa 600 μg/kg 組與GnRHa 800 μg/kg 組僅有脛骨長(zhǎng)度顯著上升（P＜0.01 或P＜0.05）。就體征指標(biāo)的改善效果來看，藥物效果由大到小分別為：rhGH+GnRHa 1000 μg/kg＞rhGH+GnRHa 800 μg/kg＞rhGH+GnRHa 600 μg/kg≥GnRHa 1000 μg/kg ＞GnRHa 800 μg/kg＞GnRHa 600 μg/kg。

表1 給藥8周性早熟大鼠體重變化（±s，n=6）

表1 給藥8周性早熟大鼠體重變化（±s，n=6）

注：與性早熟大鼠模型組比較，*P＜0.05，#P＜0.01；與正常雌性大鼠對(duì)照組比較，▲P＜0.01

組別 體重（g） 鼻尾長(zhǎng)（cm） 脛骨長(zhǎng)（cm）rhGH+GnRHa（600 μg/kg）組 196.35±20.06 41.73±1.42* 35.55±0.97#rhGH+GnRHa（800 μg/kg）組 207.32±21.63* 42.47±1.10# 35.7±1.16#rhGH+GnRHa（1000 μg/kg）組 211.62±20.21# 43.33±1.92# 35.82±1.30#GnRHa（600 μg/kg）組 185.12±18.84 40.77±1.86 34.40±0.85*GnRHa（800 μg/kg）組 190.32±20.14 41.00±1.54 34.90±1.23#GnRHa（1000 μg/kg）組 195.35±21.09 41.62±1.72* 35.28±1.09#性早熟大鼠模型組 178.80±19.23 ▲ 39.48±1.81 ▲ 32.97±1.00 ▲正常雌性大鼠對(duì)照組 214.08±22.46 43.77±1.11 36.67±0.82

2.2 血清IGF-1 含量變化情況 給藥8 周后，空白組IGF-1 含量為（388.10±39.73）ng/L，模型組大鼠IGF-1含量為（240.12±25.64）ng/L，兩組大鼠血清IGF-1 含量有顯著差異（P＜0.01）。rhGH+GnRHa（1000 μg/kg）組大鼠IGF-1 含量為（366.01±36.31）ng/L，GnRHa（1000 μg/kg）組大鼠IGF-1 含量為（305.89±30.80）ng/L，與模型組大鼠相比有顯著上升（P＜0.05）。

2.3 HE 染色觀察藥物對(duì)性早熟大鼠脛骨影響 根據(jù)圖1 可得，正常雌性大鼠對(duì)照組脛骨細(xì)胞形態(tài)正常，排列緊密，軟骨層厚度適宜，無(wú)軟骨脫失現(xiàn)象，骨小梁結(jié)構(gòu)與形態(tài)緊密正常。性早熟大鼠模型組脛骨細(xì)胞破壞嚴(yán)重，甚至出現(xiàn)大面積脫落，骨小梁稀疏碎裂，結(jié)構(gòu)紊亂。與性早熟大鼠模型組相比，給藥組大鼠細(xì)胞破壞程度較輕，細(xì)胞形態(tài)較為正常。細(xì)胞破壞程度由低到高為：rhGH+GnRHa 1000 μg/kg＞rhGH+GnRHa 800 μg/kg＞rhGH+GnRHa 600 μg/kg＞GnRHa1000 μg/kg＞GnRHa 800 μg/kg＞GnRHa 600 μg/kg。

圖1 性早熟大鼠脛骨HE染色圖（×200）

2.4 Western Blot 檢測(cè)軟骨組織蛋白表達(dá)水平 根據(jù)圖2可得，與對(duì)照組相比，模型組大鼠軟骨組織中的FGF2、FGFR3、IGF-1R 蛋白表達(dá)水平極顯著下降（P＜0.01）。與性早熟大鼠模型組相比，rhGH+GnRHa 600 μg/kg 組、rhGH+GnRHa 800 μg/kg 組、rhGH+GnRHa 1000 μg/kg組軟骨組織中的FGF2、FGFR3、IGF-1R 蛋白表達(dá)水平均極顯著上升（P＜0.01），且與給藥劑量呈正相關(guān)。GnRHa 1000 μg/kg 組 的FGF2、FGFR3、IGF-1R 蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01 或P＜0.05）；GnRHa 800 μg/kg 組的軟骨組織僅有FGF2 與IGF-1R 的蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01 或P＜0.05），F(xiàn)GFR3 則僅有上升趨勢(shì)而無(wú)顯著性（P＞0.05）；而GnRHa 600 μg/kg組大鼠軟骨組織只有FGF2 的蛋白表達(dá)水平顯著上升（P＜0.05），其余均無(wú)顯著性變化（P＞0.05）。

圖2 軟骨組織中FGF2、FGFR3、IGF-1R蛋白條帶圖與蛋白表達(dá)水平

3 討論

中樞性性早熟是兒童常見的內(nèi)分泌疾病，其發(fā)病率在1/5000～1/1000，女童高于男童［7］。GnRHa 是中樞性性早熟一線治療藥物，但是部分CPP 患者在GnRHa治療中因無(wú)法克服生長(zhǎng)減慢而影響成年身高的改善，失去繼續(xù)使用GnRHa 治療的意義，有60%的患兒未能達(dá)到靶身高［7］。國(guó)內(nèi)馬華梅等［8］對(duì)已接受GnRHa 治療＞6 個(gè)月、治療中生長(zhǎng)速度顯著減慢的15 例CPP 女孩聯(lián)用一定療程的rhGH 治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)用rhGH 能顯著加快GnRHa 治療中生長(zhǎng)過慢的CPP 女孩的生長(zhǎng)速度，推遲骨骺閉合以及改善預(yù)測(cè)成年身高。王春林等［9］對(duì)2012～2013 年就診的80 例CPP 女童進(jìn)行回顧性分析發(fā)現(xiàn)，聯(lián)用rhGH 成年身高得到明顯改善。

性早熟以女童多見，故本研究采用雌性SD 大鼠建立的性早熟大鼠模型并給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GnRHa 不同劑量組大鼠的鼻尾長(zhǎng)度和脛骨長(zhǎng)度優(yōu)于性早熟模型組，GnRHa 與rhGh 聯(lián)合給藥組明顯優(yōu)于GnRHa 單用組。GnRHa 與rhGh 聯(lián)合組血清中胰島素樣生長(zhǎng)因子IGF-1含量上升，脛骨組織切片細(xì)胞形態(tài)和排列更正常，提示GnRHa 與rhGH 聯(lián)合組大鼠鼻尾長(zhǎng)度和脛骨長(zhǎng)度較好可能與IGF-1 及脛骨軟骨板局部作用有關(guān)。

國(guó)外研究報(bào)道指出GH 可刺激肝細(xì)胞等產(chǎn)生IGF-1，刺激軟骨生長(zhǎng)板的靜息區(qū)軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)。IGF-1 可刺激骺板軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)膠原及硫酸粘多糖合成，IGF-1 亦參與蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)，從而介導(dǎo)GH 促骨縱向生長(zhǎng)作用［10-12］。GH 還可以刺激軟骨細(xì)胞IGF-1 受體表達(dá)促進(jìn)軟骨生長(zhǎng)。亦有研究報(bào)道，對(duì)脛骨IGF-1 受體基因敲除的大鼠予rhGH 刺激后，大鼠脛骨仍能正常生長(zhǎng)，提示生長(zhǎng)激素刺激軟骨生長(zhǎng)并不完全依賴GH-IGF-1 調(diào)控系統(tǒng)［13］。FGF-2 是FGFs 超家族的主要成員，具有促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖的作用，其在生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)中也起重要調(diào)節(jié)作用。FGF2 與IGF-1 有協(xié)同作用，可促進(jìn)軟骨增殖。FGF2 主要通過FGFR3 促進(jìn)軟骨增殖。觀察脛骨軟骨面中IGF-1R、FGF2、FGFR3 等蛋白表達(dá)情況，作者認(rèn)為聯(lián)用rhGH聯(lián)合GnRHa 治療性早熟大鼠生長(zhǎng)減速的作用機(jī)制與IGF、IGF-1R、FGF2、FGFR3 蛋白的相互作用和信號(hào)介導(dǎo)有關(guān)。