王軍 鄭文祥 周娜 高帥2 侯琳

(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，山東 青島 266021； 2 青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院心臟中心)

乳腺癌是最常見的惡性實體腫瘤之一，在全球范圍內(nèi)其發(fā)病率排在了第1位，在女性的惡性腫瘤中占比約為20%，是女性的主要死亡原因之一[1-2]。由于乳腺癌早期篩查工作的普及，可以做到早期發(fā)現(xiàn)確診[3-4]，乳腺癌早期經(jīng)手術(shù)、放療、化療以后可取得較好的預(yù)后，但晚期乳腺癌的預(yù)后仍不理想，患者總體生存率僅為26%[5-6]。而且乳腺癌易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，嚴(yán)重影響了患者的生存時間和質(zhì)量[7]。外泌體是細(xì)胞分泌的由核酸(如ncRNA、DNA)及蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等組成的具有磷脂雙分子層的橢圓形外囊泡分子，直徑40～100 nm，廣泛存在于血液、尿液、羊水、腹水等體液中[8-10]。外泌體作為一種重要的介體，常被稱為癌癥調(diào)節(jié)劑，對肝癌、肺癌等腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移、血管生成以及腫瘤微環(huán)境的構(gòu)建發(fā)揮重要作用[11-12]。目前國內(nèi)外關(guān)于腫瘤細(xì)胞自身所分泌的外

泌體與腫瘤的相關(guān)性研究并不多，本研究就乳腺癌BT549細(xì)胞自身分泌的外泌體對乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞功能學(xué)的影響進行研究，探討自身分泌的外泌體對細(xì)胞自身的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。 現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人乳腺癌BT549細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生物研究所細(xì)胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶消化液、胎牛血清購自美國HyClone公司；青鏈霉素混合液購自北京索萊寶生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自上海漢恒生物科技有限公司；牛血清白蛋白 (BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；TSG101抗體、CD63抗體購自英國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

乳腺癌BT549細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(FBS)、10×107U/L青霉素與10 g/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度達 90%以上時, 用胰蛋白酶消化液消化，收集細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)，將細(xì)胞傳代于6孔板中。

1.3 外泌體的提取

使用超速離心法對BT549細(xì)胞培養(yǎng)上清液進行外泌體的提取和純化。當(dāng)乳腺癌BT549細(xì)胞密度達50%左右時，更換培養(yǎng)基為含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS的不含外泌體DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液；4 ℃下依次以1 000 r/min離心10 min，5 000 r/min離心10 min，10 000 r/min離心30 min，每次離心后分別收集上清液以后再進行下一次的離心操作，最后以100 000 r/min離心90 min后棄掉上清液，收集沉淀物，以PBS緩沖液重懸后，再以100 000 r/min離心90 min，然后收集沉淀物，獲得外泌體。用100 μL PBS緩沖液重懸外泌體，如立即使用保存于4 ℃冰箱，長期使用保存于-80 ℃超低溫冰箱。

1.4 外泌體的形態(tài)觀察

取上述提取的外泌體溶液10 μL，滴于銅網(wǎng)支持膜上，室溫靜置 2 min，用濾紙吸干多余液體；將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02的磷鎢酸溶液10 μL滴加在銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染 2 min， 濾紙吸干多余液體；白熾燈下晾干15 min，于80～120 kV工作電壓下，以透射電子顯微鏡觀察外泌體的形態(tài)及大小，拍照保存。

1.5 蛋白免疫印記(Western-blot)實驗檢測外泌體標(biāo)志蛋白

嚴(yán)格參照蛋白質(zhì)微量提取試劑盒說明書的步驟操作，從提取的外泌體中提取總蛋白，采用 BCA法測定蛋白濃度。將提取的蛋白加入含體積分?jǐn)?shù)0.25的十二烷基硫酸鈉的緩沖溶液中，沸水浴5 min，冷卻后離心，取定量蛋白進行SDS蛋白電泳，PVDF 轉(zhuǎn)膜，快速封閉液封閉15 min，一抗室溫孵育2.5 h后，TBST溶液洗膜，二抗室溫孵育1.5 h，TBST溶液洗膜，ECL顯影液顯影，拍照并保存。

1.6 CCK-8法檢測外泌體對BT549細(xì)胞增殖影響

乳腺癌BT549細(xì)胞生長密度達85%～90%且處于對數(shù)生長期時，以胰蛋白酶進行消化，吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，計數(shù)細(xì)胞后接種于96孔板中，每孔接種2 000個細(xì)胞，設(shè)置5個復(fù)孔。實驗分為對照組(僅含有乳腺癌BT549細(xì)胞，不含有外泌體的培養(yǎng)基)、實驗組(含乳腺癌BT549細(xì)胞及其外泌體的培養(yǎng)基)，分別在共培養(yǎng)0、12、24、36、48 h后，按照CCK8試劑盒的說明書步驟每孔加入10 μL CCK-8溶液，于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2.5 h后，以酶標(biāo)儀測量各孔在450 nm波長處的吸光度值。

1.7 細(xì)胞劃痕實驗檢測外泌體對BT549細(xì)胞遷移的影響

使用細(xì)胞劃痕實驗檢測外泌體對BT549細(xì)胞遷移的影響。取細(xì)胞生長密度達到85%～90%時的BT549細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計數(shù)后接種于6孔板之中，每孔約50 000個細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞生長密度達到95%時,用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，用槍頭垂直于6孔板標(biāo)線畫線，用PBS緩沖液沖洗2次，實驗組加入無血清且含有外泌體培養(yǎng)基，對照組加入無血清且不含有外泌體的培養(yǎng)基，分別于BT549細(xì)胞培養(yǎng)0、24 h時，用倒置顯微鏡觀察并拍照，用Image J軟件測量愈合面積并計算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕面積-24 h培養(yǎng)后劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.8 Transwell實驗檢測外泌體對BT549細(xì)胞侵襲的影響

取細(xì)胞生長密度達到85%～90%時BT549細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基饑餓處理12 h，胰蛋白酶消化細(xì)胞，吹打細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞計數(shù)調(diào)整細(xì)胞濃度為200×106個/L，將200 μL細(xì)胞懸液接種于Transwell小室的上室，下室加入600 μL體積分?jǐn)?shù)0.30血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱孵育24 h。甲醇固定10 min后,以質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.01的結(jié)晶紫染色液染色20 min，倒置顯微鏡下觀察并拍照，用Image J軟件計算穿過基質(zhì)膠的細(xì)胞數(shù)。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 外泌體形態(tài)觀察以及外泌體標(biāo)志蛋白的檢測結(jié)果

透射電子顯微鏡下觀察可見外泌體形狀為經(jīng)典的橢圓形，直徑40～100 nm，外包被一層磷脂雙分子膜(圖1A)。Western-blot實驗檢測結(jié)果顯示，在提取的外泌體中檢測到其標(biāo)志性的蛋白TSG101、CD63蛋白(圖1B)。

2.2 外泌體對BT549細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響結(jié)果

將BT549細(xì)胞自身分泌的外泌體與BT549細(xì)胞共培養(yǎng)0、12、24、36、48 h，觀察兩組細(xì)胞增殖情況，重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果顯示,時間、組別、時間與組別對乳腺癌細(xì)胞BT549增殖能力均有明顯影響(F時間=970.316,F組別=117.178,F時間*組別=28.318，P<0.001)。單獨效應(yīng)分析結(jié)果顯示,與0 h相比,兩組細(xì)胞的增殖能力明顯增強(F=592.84、1 126.15，P<0.001)；與對照組相比,共培養(yǎng)24、36、48 h時實驗組的細(xì)胞增殖能力明顯高于對照組細(xì)胞(F=12.99～50.95，P<0.001)。見表1。

A:透射電子顯微鏡下觀察外泌體形態(tài)和大小，B:外泌體標(biāo)志蛋白

表1 外泌體對BT549細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果示，對照組和實驗組的細(xì)胞遷移率分別為0.55±0.02和0.79±0.02，兩組比較差異有顯著性(t=8.93,P<0.01)。見圖2。

A:對照組BT549細(xì)胞遷移情況，B:實驗組BT549細(xì)胞遷移情況

Transwell實驗結(jié)果顯示，對照組和實驗組透過基質(zhì)膠的細(xì)胞個數(shù)分別為21.33±1.45和12.33±1.20，兩組比較具有顯著差異(t=4.73,P<0.01)。見圖3。

A:對照組BT549 細(xì)胞侵襲情況，B:實驗組BT549 細(xì)胞侵襲情況

3 討 論

外泌體為一個納米級的囊泡，在細(xì)胞之間、細(xì)胞與微環(huán)境之間的物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要的橋梁作用[13]。腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和物質(zhì)交換方式主要有兩種，一種是細(xì)胞與細(xì)胞間的直接物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)，另一種是通過周圍細(xì)胞進行間接的物質(zhì)交換和信號傳導(dǎo)。外泌體的主動釋放機制是一種腫瘤細(xì)胞與周圍的細(xì)胞相互作用的新機制，外泌體將其內(nèi)含的物質(zhì)傳遞給周圍細(xì)胞，實現(xiàn)細(xì)胞間的物質(zhì)交換和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8]。外泌體通過多種途徑促進腫瘤的增殖侵襲與轉(zhuǎn)移，如增加腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力和促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)移前微環(huán)境形成；增加腫瘤的血管形成，改變血管的通透性，參與形成免疫抑制微環(huán)境維持細(xì)胞增殖；逃避機體的免疫監(jiān)督，在形成腫瘤代謝微環(huán)境等多方面發(fā)揮著重要作用[14-15]。本文研究了乳腺癌BT549細(xì)胞分泌的外泌體對乳腺癌細(xì)胞自身的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響，實驗結(jié)果表明腫瘤來源的外泌體可作為一個交叉信號傳導(dǎo)平臺，在腫瘤的形成和生長等方面發(fā)揮自分泌作用，在促進腫瘤細(xì)胞生長方面發(fā)揮自分泌和旁分泌的作用，這一理論最早由QU等[16]于外泌體在胃癌中的作用研究中提出。

腫瘤微環(huán)境指腫瘤細(xì)胞周圍的各種正常細(xì)胞、信號分子、血管和細(xì)胞外基質(zhì)，常被比作腫瘤細(xì)胞生長的土壤，在調(diào)控腫瘤進展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，目前僅有少量學(xué)者研究外泌體在乳腺癌腫瘤微環(huán)境中的作用[14]。外泌體是微環(huán)境的重要組成部分，可以由腫瘤細(xì)胞釋放到細(xì)胞外基質(zhì)進而進入循環(huán)系統(tǒng)，且外泌體中含有的蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)，可以作為腫瘤早期診斷以及預(yù)后檢測的新型標(biāo)志物。SCHW-ARZENBACH等[17]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者的血清外泌體中miR-21以及miR-1246的表達水平明顯升高，GALINDO等[18]發(fā)現(xiàn)在乳腺癌患者血清和胸腔積液的外泌體中基質(zhì)金屬蛋白酶10、熱激蛋白90、膜聯(lián)蛋白-1中異常表達，同時還在乳腺癌血漿外泌體中檢測到發(fā)育內(nèi)皮基因座-1以及纖維連接蛋白異常表達[19-20]，因此miR-21、miR-1246、發(fā)育內(nèi)皮基因座-1和纖維連接蛋白均可以作為乳腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。惡性增殖是乳腺癌的重要特征，抑制乳腺癌細(xì)胞的惡性增殖是治療乳腺癌的重要治療手段，紫草素和鹵夫酮可以抑制乳腺癌細(xì)胞外泌體的釋放，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[21-22]。侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌的另一重要特征，轉(zhuǎn)移性乳腺癌可以危及生命安全,因此抑制乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移是另一治療手段[23-25]。外泌體中的蛋白質(zhì)、miRNA可通過激活一些信號通路影響乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[26]。PIAO等[27]證實，乳腺癌細(xì)胞來源的外泌體的增殖可通過刺激巨噬細(xì)胞極化的途徑為淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件。研究發(fā)現(xiàn)外泌體中的miR-105可以減少緊密蛋白的表達，破壞細(xì)胞間的緊密連接，從而促進細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[28]?？梢娡饷隗w有望成為乳腺癌早期篩查的快速、簡便的標(biāo)志物，并可能對乳腺癌的治療提供新思路。

本研究通過對乳腺癌BT549細(xì)胞來源的外泌體進行提取以及鑒定，首次證明了人乳腺癌細(xì)胞BT549來源的外泌體可以促進腫瘤細(xì)胞自身的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。但其中分子調(diào)控機制尚不明確。雖然對外泌體的研究逐步深入，其在液體活檢和藥物遞送方面已在臨床獲得初步應(yīng)用，但在腫瘤臨床診療中的應(yīng)用仍處于初級階段[29-30]。相信在多學(xué)科的共同努力下，外泌體一定會在臨床上展現(xiàn)出更多的應(yīng)用價值，在不久的將來，越來越多的外泌體潛在應(yīng)用價值將會被發(fā)現(xiàn)并逐步應(yīng)用于臨床。