(1 青島大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，山東 青島 266003； 2 單縣中心醫(yī)院病理科； 3 青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科)

惡性間皮瘤(MM)是一種罕見(jiàn)的間皮源性惡性腫瘤，因組織形態(tài)多樣，其診斷及與轉(zhuǎn)移性腺癌、反應(yīng)性間皮細(xì)胞增生(RMH)的鑒別診斷存在困難，尤其與RMH的鑒別更是一個(gè)挑戰(zhàn)。目前用于兩者輔助鑒別診斷的免疫組織化學(xué)抗體對(duì)其診斷特異度及靈敏度均不高[1]。zeste基因增強(qiáng)子人類(lèi)同源物 2(EZH2)是新發(fā)現(xiàn)的具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶活性的腫瘤相關(guān)蛋白，參與細(xì)胞的周期調(diào)控、衰老、分化以及腫瘤發(fā)生等病理生理過(guò)程，該蛋白的異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移[2-3]。胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白3(IMP3)作為一種新識(shí)別的mRNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ的轉(zhuǎn)錄，影響胚胎組織增殖，其高表達(dá)與多種惡性腫瘤患者預(yù)后不良相關(guān)，而陰性或弱表達(dá)被認(rèn)為是良性或低級(jí)別病變[4-6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(Glut1)作為哺乳動(dòng)物細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體，為腫瘤細(xì)胞攝取葡萄糖提供跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的強(qiáng)弱或與腫瘤的惡性程度相關(guān)[7-8]。為驗(yàn)證上述論斷，本文采用免疫組化方法檢測(cè)EZH2、IMP3、Glut1蛋白在MM和RMH組織中的表達(dá)狀況，探討其在MM的診斷及預(yù)后判斷中的意義?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

收集單縣中心醫(yī)院2013-2018年經(jīng)病理診斷為MM的蠟塊標(biāo)本50例，診斷和分類(lèi)均按照《惡性間皮瘤病理診斷指南》[9]標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。所有病例均由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資診斷醫(yī)師雙盲法閱片復(fù)診。本組病例男17例，女33例；年齡39～76歲，平均60歲；發(fā)生于胸膜18例，腹膜 32例；組織學(xué)形態(tài)呈上皮型29例，肉瘤型10例，雙相型11例；40例患者有石棉接觸史。所有患者術(shù)前均未行放化療或免疫治療。同時(shí)選取20例RMH樣本作為對(duì)照組，其中男13例，女7例；年齡42～74歲，平均59歲。

1.2 主要試劑

兔多克隆抗體EZH2購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，兔抗人IMP3單克隆抗體(克隆號(hào)EP286)、鼠抗人Glut1單克隆抗體(克隆號(hào)SPM498)及二抗試劑盒均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司。

1.3 研究方法及判定標(biāo)準(zhǔn)

所有標(biāo)本經(jīng)石蠟包埋，常規(guī)4 μm厚切片，分別行HE染色和免疫組織化學(xué)SP法染色。以PBS液替代一抗作為陰性對(duì)照，用已知的EZH2陽(yáng)性的乳腺癌組織、IMP3陽(yáng)性的胰腺癌組織及Glut1陽(yáng)性的胎盤(pán)組織作為陽(yáng)性對(duì)照。綜合分析每張切片中細(xì)胞的染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比，對(duì)染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分，兩項(xiàng)指標(biāo)分?jǐn)?shù)乘積>3分為陽(yáng)性表達(dá)[10]。

1.4 隨訪

通過(guò)電話聯(lián)系及調(diào)閱電子病歷進(jìn)行隨訪，隨訪截至2020年5月，患者生存期從最初診斷截至死亡，以月為單位計(jì)算。

2 結(jié) 果

2.1 EZH2、IMP3、Glut1在MM及RMH組織中的表達(dá)情況

EZH2陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞核中，部分伴細(xì)胞質(zhì)著色，以淋巴細(xì)胞作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，50例MM中(圖1A～C)陽(yáng)性表達(dá)率為88%，20例RMH中(圖1D)陽(yáng)性表達(dá)率為10%，EZH2在MM與RMH組織中的表達(dá)差異有顯著性(χ2=35.19，P<0.05)。IMP3定位于細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中，以淋巴細(xì)胞作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，50例MM中(圖1E～G)陽(yáng)性表達(dá)率為60%，而20例RMH中(圖1H)陽(yáng)性表達(dá)率為5%，IMP3在MM與RMH中的表達(dá)差異具有顯著意義(χ2=15.36，P<0.05)。Glut1定位于細(xì)胞膜，以組織內(nèi)紅細(xì)胞作為陽(yáng)性內(nèi)對(duì)照，Glut1在50例MM中(圖1I～K)陽(yáng)性表達(dá)率為68%，20例RMH(圖1L)中均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)，Glut1在MM與RMH組織中的表達(dá)差異有顯著性(χ2=26.46，P<0.05)。

2.2 EZH2、IMP3、Glut1及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MM診斷的價(jià)值

研究結(jié)果示，EZH2并IMP3、EZH2并Glut1、IMP3并Glut1、EZH2并IMP3并Glut1對(duì)MM診斷的靈敏度分別為90%、98%、84%、98%。其他見(jiàn)表1。

表1 EZH2、IMP3、Glut1聯(lián)合檢測(cè)對(duì)MM診斷的價(jià)值

2.3 EZH2、IMP3、Glut1表達(dá)與MM患者臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

IMP3表達(dá)與MM患者發(fā)病部位有關(guān)(χ2=5.22，P<0.05)，而與其他各項(xiàng)臨床病理參數(shù)無(wú)關(guān)(P>0.05)；EZH2、Glut1表達(dá)與MM患者臨床病理學(xué)參數(shù)無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 EZH2、IMP3、Glut1表達(dá)與MM患者預(yù)后的關(guān)系

本組50例MM患者隨訪資料完整，隨訪率100%。截至隨訪，50例患者均死于該疾病。1年總生存率為26%，兩年總生存率為2%。IMP3陽(yáng)性表達(dá)的患者平均生存時(shí)間為9個(gè)月，1年總生存率為20%，陰性表達(dá)者平均生存時(shí)間為12個(gè)月，1年總生存率為50%，IMP3陽(yáng)性表達(dá)者生存率較陰性表達(dá)者顯著降低，差異有顯著意義(χ2=10.35，P<0.05)；EZH2及Glut1陽(yáng)性表達(dá)者與陰性表達(dá)者生存率比較差異均無(wú)顯著性(P>0.05)。

A～C：EZH2在上皮樣、肉瘤樣及雙相型MM組織中均陽(yáng)性表達(dá)；D：EZH2在RMH組織中失表達(dá)；E～G：IMP3在上皮樣、肉瘤樣及雙相型MM組織中均陽(yáng)性表達(dá)；H：IMP3在RMH組織中失表達(dá)；I～K：Glut1在上皮樣、肉瘤樣及雙相型MM組織中均陽(yáng)性表達(dá)；L：Glut1在RMH組織中失表達(dá)。SP法，100倍

表2 EZH2、IMP3、Glut1表達(dá)與MM患者臨床病理特征的關(guān)系

3 討 論

MM是源于漿膜腔被覆的間皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其形態(tài)學(xué)復(fù)雜，需要與RMH、轉(zhuǎn)移癌等多種良惡性病變進(jìn)行鑒別診斷，盡管RMH與MM在大部分情況下區(qū)別是明顯的，但是在穿刺活檢組織較少或組織學(xué)不典型的情況下，單從形態(tài)上很難區(qū)分是增生還是腫瘤，因此除常規(guī)形態(tài)學(xué)特征外，聯(lián)合應(yīng)用多種生物標(biāo)記可用于兩者的診斷和鑒別診斷[11-14]。有研究認(rèn)為Desmin和EMA是最常應(yīng)用的免疫標(biāo)記物[15]，然而，這些標(biāo)記物對(duì)MM診斷的靈敏度與特異度均低于90%，在日常臨床實(shí)踐中作用有限。最近，有研究提示EZH2、IMP3及Glut1在MM中過(guò)表達(dá)，而在RMH中低表達(dá)或不表達(dá)，因此，預(yù)測(cè)它們?cè)谂R床病理診斷上可能具有一定的應(yīng)用價(jià)值，為了驗(yàn)證這一推測(cè)，本研究對(duì)50例MM中EZH2、IMP3及Glut1的表達(dá)及其意義進(jìn)行了初步探索。

EZH2是PcG基因家族的核心成員，在表觀遺傳沉默以及細(xì)胞周期中發(fā)揮著重要作用。EZH2通過(guò)靶向催化組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化(H3K27m3)從而沉默與細(xì)胞分化、抑制增殖在內(nèi)的基因，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[16-17]，并與腫瘤的惡性進(jìn)展、侵襲性及轉(zhuǎn)移能力關(guān)系密切[18]。目前，已在多種惡性腫瘤中證實(shí)EZH2蛋白過(guò)表達(dá)，而在對(duì)應(yīng)的正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)[19-20]。此外，過(guò)表達(dá)與腫瘤的增殖和患者的預(yù)后差密切相關(guān)[21]。高勝男等[22]研究了67例MM中EZH2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示診斷的靈敏度為77.6%。有研究顯示EZH2高表達(dá)對(duì)MM診斷具有比較高的特異度，可與RMH進(jìn)行鑒別[23]。本研究中EZH2診斷MM的靈敏度為88%，特異度為90%，在MM中陽(yáng)性表達(dá)率顯著高于RMH，提示EZH2在MM與RMH的鑒別診斷中有一定的應(yīng)用價(jià)值。

IMP3是胰島素樣因子RNA結(jié)合蛋白家族中的一員，調(diào)節(jié)胰島素樣生長(zhǎng)因子Ⅱ轉(zhuǎn)錄，在胚胎發(fā)生早期的RNA定位和穩(wěn)定以及細(xì)胞生長(zhǎng)中起著重要的作用[24]。IMP3也是癌胚蛋白，有研究報(bào)道其表達(dá)與多種惡性腫瘤相關(guān)，如胰腺癌、腎癌、肺癌及胃癌等，而在正常細(xì)胞、反應(yīng)性增生細(xì)胞和良性腫瘤細(xì)胞中通常呈陰性表達(dá)[25-26]，表明IMP3是區(qū)分惡性腫瘤與良性病變的重要生物標(biāo)記物。有研究應(yīng)用免疫組化法檢測(cè)45例MM中IMP3的表達(dá)，結(jié)果顯示33(73%)例呈陽(yáng)性表達(dá)，而64例RMH中均無(wú)表達(dá)[27]。本研究50例MM中有30例呈陽(yáng)性表達(dá)(60%)，20例RMH中僅1例呈陽(yáng)性表達(dá)(5%)，本研究結(jié)果顯示IMP3是區(qū)分MM與RMH的重要提示標(biāo)志物。進(jìn)一步分析顯示IMP3表達(dá)與患者發(fā)病部位有關(guān)，發(fā)生于腹膜者IMP3表達(dá)多于發(fā)生于胸膜者，可能與本組患者腹膜發(fā)病者(腹膜/胸膜比為1.8∶1)比例高有關(guān)，而其表達(dá)與患者年齡、性別、組織分型、石棉接觸史等均無(wú)關(guān)。Kaplan-Meier法分析顯示IMP3表達(dá)與患者的總生存期有關(guān)，提示IMP3是影響MM預(yù)后的重要因素。

Glut1是葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的成員，促進(jìn)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞，廣泛表達(dá)于正常人的紅細(xì)胞、胎盤(pán)的滋養(yǎng)葉細(xì)胞和合體滋養(yǎng)葉細(xì)胞、血腦屏障的內(nèi)皮細(xì)胞中，而在其他正常組織中不表達(dá)。但當(dāng)細(xì)胞增生活躍、轉(zhuǎn)化或惡變時(shí)，細(xì)胞膜葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)增加，可導(dǎo)致Glut1異常高表達(dá)[28]。據(jù)報(bào)道在包括子宮內(nèi)膜癌、胃癌以及腎細(xì)胞癌等多種惡性上皮性腫瘤中均有Glut1的過(guò)表達(dá)[29]。研究發(fā)現(xiàn)，Glut1在RMH患者中的陽(yáng)性表達(dá)率為13.8%，在MM中為88.0%[1]。本研究結(jié)果顯示，Glut1對(duì)MM診斷的靈敏度與特異度分別為68%、100%，說(shuō)明Glut1是一種有效的免疫組織化學(xué)標(biāo)記物，可用于MM與RMH的鑒別診斷。

本研究首次采用了免疫組化的方法聯(lián)合檢測(cè)EZH2、IMP3及Glut1在MM和RMH組織中的表達(dá)。在50例MM中EZH2、IMP3及Glut1的陽(yáng)性表達(dá)率均高于20例RMH，其中EZH2的陽(yáng)性表達(dá)率最高(88%)，但也有10%的RMH患者陽(yáng)性表達(dá)EZH2。本文結(jié)果還顯示，Glut1對(duì)MM的診斷特異度為100%，但其診斷靈敏度在3個(gè)抗體中最低，僅為68%。因此，我們認(rèn)為單獨(dú)檢測(cè)3種抗體對(duì)MM及RMH的鑒別診斷價(jià)值有限，但聯(lián)合檢測(cè)EZH2、IMP3及Glut1，尤其是EZH2以及Glut1聯(lián)合檢測(cè)對(duì)診斷MM的靈敏度以及特異度可分別達(dá)到98%、90%，對(duì)MM和RMH的鑒別診斷具有較高應(yīng)用價(jià)值。

綜上所述，MM和RMH的鑒別診斷要結(jié)合臨床、組織形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和免疫組化檢測(cè)結(jié)果等綜合判斷，同時(shí)聯(lián)合檢測(cè)EZH2、IMP3及Glut1 3種抗體對(duì)MM的準(zhǔn)確診斷和患者預(yù)后判斷有重要價(jià)值。