楊 帆 ， 楊玉波 ， 劉延峰 ， 李江華 ， 王 莉 ， 陳 堅(jiān) *，5

（1.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122；2.貴州茅臺(tái)酒股份有限公司，貴州 遵義564501；3.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；4.中國貴州茅臺(tái)酒廠（集團(tuán)）有限責(zé)任公司，貴州 遵義 564501；5.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

乳酸菌被廣泛用于發(fā)酵乳制品、酸菜、泡菜等發(fā)酵食品中，其中乳酸是乳酸菌利用糖類發(fā)酵代謝的主要終產(chǎn)物[1-3]。 乳酸也是中國白酒中主要的有機(jī)酸之一，能減少酒精的刺激感，降低酒的澀味從而使酒體更加豐滿醇和。 此外，乳酸還是風(fēng)味物質(zhì)乳酸乙酯的重要前體物質(zhì)，乳酸乙酯能夠增加酒體的醇甜感、醇厚度，是重要的呈味和呈香物質(zhì)[4]。 同時(shí)，乳酸還具有調(diào)節(jié)其他釀造微生物生長的作用，這對白酒釀造具有重要的意義[5-7]。

醬香白酒是中國最受歡迎的白酒之一，其生產(chǎn)需要經(jīng)兩次投料（下沙和造沙）和多輪次發(fā)酵。 隨著溶氧的降低和酸度的增加，在每一個(gè)輪次的固態(tài)發(fā)酵的中后期，乳酸菌便成為酒醅中的優(yōu)勢菌[8]。 發(fā)酵產(chǎn)物，尤其是乳酸等非揮發(fā)性產(chǎn)物不可避免地會(huì)影響下一輪次的微生物群落結(jié)構(gòu)，從而進(jìn)一步影響下一輪次產(chǎn)酒的產(chǎn)量和質(zhì)量。 Lactobacillus panis 是一種厭氧的專性異型乳酸發(fā)酵乳酸菌，屬于第Ⅲ類型乳桿菌，其發(fā)酵終產(chǎn)物為乳酸、乙酸、乙醇和CO2[9]。L.panis 最早是從發(fā)面中分離出的， 是一種廣泛存在于谷物類發(fā)酵制品中的典型乳桿菌[10-11]。 前期研究發(fā)現(xiàn)，L.panis 是造沙輪次中主要的產(chǎn)乳酸微生物[12]。因此，其生長和乳酸代謝對后續(xù)生產(chǎn)過程中微生物群落結(jié)構(gòu)、基酒的產(chǎn)量、風(fēng)味均有重要影響。

乳酸菌的生長和代謝取決于其對pH、 溫度和營養(yǎng)等環(huán)境條件的感知和響應(yīng)能力[13]。因此，改變這些環(huán)境條件會(huì)影響L.panis 的乳酸合成。 明晰這一調(diào)節(jié)機(jī)制將為通過調(diào)節(jié)釀造環(huán)境條件來控制乳酸合成提供指導(dǎo)，從而為實(shí)現(xiàn)醬香型白酒的質(zhì)量提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和培養(yǎng)基

1.1.1 菌株本研究所用菌株為從醬香白酒酒醅中分離獲得的L.panis。

1.1.2 改良MRS 培養(yǎng)基的制備將醬香型白酒生產(chǎn)過程中的酒醅與水以1 g∶2 mL 的比例混合，400 r/min 振蕩 15 min，然后 30 ℃超聲 20 min，過濾超聲后的浸提液， 然后將濾液5 000 r/min 離心10 min，取上清液。 將制備的酒醅浸提液與MRS 液態(tài)培養(yǎng)基以1 mL∶1 g 的比例混合，在滅菌之前將改良MRS 培養(yǎng)基的 pH 調(diào)節(jié)至 5.0。經(jīng)測定，改良 MRS 培養(yǎng)基中含葡萄糖15 g/L、乙醇0.5 g/L、乳酸2.5 g/L。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件

1）菌種復(fù)蘇擴(kuò)培 將L.panis接種于液態(tài)MRS培養(yǎng)基中， 于37 ℃條件下厭氧培養(yǎng)至A600nm為1.0左右。

2） 種子液接種 將擴(kuò)培后的種子液以體積分?jǐn)?shù)2%的量接種于不同類型的發(fā)酵培養(yǎng)基中， 分析不同溫度、乳酸質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)及葡萄糖質(zhì)量濃度對L.panis 的乳酸代謝的影響。

3）溫度條件 將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基后，分別置于 30、37、42、45 ℃下培養(yǎng)。

4） 乳酸質(zhì)量濃度 將種子液分別接種于含4、8、10、15 g/L 乳酸的改良 MRS 培養(yǎng)基中后，37 ℃下培養(yǎng)。

5） 乙醇體積分?jǐn)?shù) 將種子液分別接種于含乙醇體積分?jǐn)?shù)0.5%、1.0%、2.0%、4.0%改良MRS 培養(yǎng)基中后，37 ℃下培養(yǎng)。

6） 葡萄糖質(zhì)量濃度 將種子液分別接種于含20、40、80、120 g/L 葡萄糖的改良 MRS 培養(yǎng)基后，37 ℃下培養(yǎng)。

7）對照 將種子液接種于不額外添加乳酸、乙醇和葡萄糖的改良MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)作為對照。

1.2 方法

1.2.1 L.panis 生長曲線的測定將菌種活化接種于不同條件下后， 以不含菌液的改良MRS 培養(yǎng)基作為對照， 定時(shí)在波長600 nm 處測定培養(yǎng)液的吸光度值（A600nm），每組實(shí)驗(yàn)3 個(gè)平行，取均值。以A600nm為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制生長曲線圖。

1.2.2 L.panis 乳酸產(chǎn)量的測定在發(fā)酵開始和結(jié)束時(shí)， 使用高效液相色譜 （HPLC） 系統(tǒng) （安捷倫1260，安捷倫科技公司產(chǎn)品）測定發(fā)酵液中的乳酸含量。 取發(fā)酵液 1 mL 在 4 ℃下 12 000 r/min 離心10 min，將上清液稀釋，然后使用膜濾（0.22 μm）過濾。 使用C18 色譜柱通過以下條件進(jìn)行乳酸測定：色譜柱溫度為30 ℃，含體積分?jǐn)?shù)0.2%甲醇的磷酸水溶液（A）和超純水（B）用作流動(dòng)相，流量0.8 mL/min，進(jìn)樣體積為 10 μL。

1.2.3 總RNA 提取菌體培養(yǎng)至對數(shù)期時(shí)， 取培養(yǎng)液 2 mL，4 ℃下 12 000 r/min 離心 2 min 收集菌體， 仔細(xì)去除上清液后， 用含溶菌酶的TE 緩沖液100 μL 徹底重懸菌體，37 ℃孵育 10 min。 按照RNAprep pure Cell / Bacteria Kit（Tiangen）提取說明書提取總RNA， 并電泳判斷RNA 的完整性。 總RNA 濃度通過使用Thermo Spectronic 分光儀測量260 nm 處的吸光度確定。

1.2.4 cDNA 合成使用PrimeScriptTMRT 試劑盒和gDNA Eraser（TaKaRa）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，其中反轉(zhuǎn)錄體系的RNA 質(zhì)量為1 μg，反轉(zhuǎn)錄體系為20 μL。 反應(yīng)條件：37 ℃變性 5 min 后，在 37 ℃下反應(yīng)15 min。 最后，將反應(yīng)在 85 ℃滅活 5 s。 反轉(zhuǎn)錄后的樣品在-20 ℃條件下保存， 用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR）不同條件下，靶標(biāo)基因的表達(dá)水平使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII（Takara）試劑盒進(jìn)行分析，其中靶標(biāo)基因和內(nèi)參基因（16S rDNA）的引物根據(jù)L.panis 全基因組序列進(jìn)行設(shè)計(jì)， 具體見表1。 反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL；上下游引物各 0.8 μL，cDNA 反應(yīng)液 1.6 μL，滅菌重蒸水6.8 μL，總體系為 20 μL。

使用 Roche Cobas?480 進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，不同反應(yīng)體系樣品做3 個(gè)重復(fù)。 反應(yīng)程序：預(yù)變性：95 ℃ 30 s；PCR 反應(yīng)：95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，循環(huán)40 次。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Table 1 Primers used in quantitative real-time PCR analysis

續(xù)表1

2 結(jié)果與討論

2.1 不同環(huán)境條件下L.panis 的生長情況

將醬香型白酒固態(tài)發(fā)酵初期的條件 （37 ℃，60 g/L 葡萄糖，無乳酸和乙醇）作為對照組，不同環(huán)境條件對L.panis 生長情況的影響如圖1 所示。 由結(jié)果可知，L.panis 的最佳生長溫度為42 ℃， 其A600nm值最高為 1.14，比對照高 7.7%，見圖1（a）。 相比之下，在30 ℃和45 ℃下，其最高A600nm值分別比對照低31.1%和39.7%。 此外， 添加乳酸能顯著促進(jìn)L.panis 的生長，當(dāng)乳酸質(zhì)量濃度為8.0 g/L 時(shí)，其A600nm值最高達(dá) 1.38，比對照高約 30.4 %，見圖1（b），相反地，當(dāng)添加乙醇體積分?jǐn)?shù)至4.0%時(shí)，L.panis 的最大A600nm下降約 37.8%，見圖1（c）。 當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度在 20～80 g/L 時(shí)，L.panis 的生長情況較好， 隨著葡萄糖質(zhì)量濃度的進(jìn)一步提高，L.panis 的生長開始受到抑制，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為120 g/L 時(shí)，其最高A600nm值已降至 0.95，見圖1（d）。

不同環(huán)境條件下L.panis 的生長變化充分說明了在釀造過程中， 環(huán)境變化會(huì)顯著影響L.panis 的生長。 發(fā)酵過程中，微生物的代謝受一系列環(huán)境因素的影響，這些環(huán)境因素決定了微生物的生存環(huán)境[14-15]。 本研究結(jié)果中，L.panis 可以在 45 ℃下良好生長，這可以歸因于經(jīng)過醬香酒生產(chǎn)過程（發(fā)酵過程溫度可達(dá)45 ℃）的長期馴化后，其對高溫產(chǎn)生了良好的適應(yīng)性。

2.2 不同環(huán)境條件下L.panis 的乳酸產(chǎn)量

通過比較不同環(huán)境條件擾動(dòng)下L.panis 的乳酸產(chǎn)量來初步判定環(huán)境條件對L.panis 乳酸合成的影響。 結(jié)果表明，37 ℃下 L.panis 的乳酸產(chǎn)量最高，為10.9 g/L，分別比 30、42 ℃和 45 ℃高 7.9%、19.7%和11.2%，見圖2（a）。 此外，添加適量的乳酸會(huì)促進(jìn)L.panis 的生長及乳酸產(chǎn)量。 在培養(yǎng)基中，由于乳酸不僅調(diào)節(jié)pH，而且還可以用作代謝前體物質(zhì)，因此，添加乳酸可能會(huì)促進(jìn)L.panis 的生長和產(chǎn)酸。 當(dāng)乳酸添加量為10 g/L 時(shí)，L.panis 的乳酸產(chǎn)量為12.3 g/L（培養(yǎng)基中的乳酸總質(zhì)量濃度為22.3 g/L），然而，當(dāng)乳酸添加量高于10 g/L 后，L.panis 的乳酸產(chǎn)量會(huì)隨著乳酸添加量的增加而減少，見圖2（b）。 相反地，與對照相比，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，L.panis的乳酸產(chǎn)量隨之減少， 當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為4.0%時(shí)，L.panis 的乳酸質(zhì)量濃度降低約34.3%，結(jié)果見圖2（c）。 同時(shí)，乙醇對L.panis 乳酸產(chǎn)量的影響趨勢與其對L.panis 的生長影響趨勢一致。 此外，L.panis的最適葡萄糖質(zhì)量濃度為60 g/L， 其乳酸產(chǎn)量為10.9 g/L，見圖2（d）。 從乳酸產(chǎn)量初步判定，釀造過程中影響L.panis 乳酸合成的主要環(huán)境因素為乳酸和乙醇。

圖1 不同條件下L.panis 的生長情況Fig.1 Cell growth of L.panis under different temperature

圖2 不同條件下L.panis 的乳酸產(chǎn)量Fig.2 Yield of lactic acid produced by L.panis under different conditions

2.3 不同環(huán)境條件下L.panis 乳酸合成關(guān)鍵基因表達(dá)水平的分析

根據(jù)不同環(huán)境條件下L.panis 的乳酸產(chǎn)量結(jié)果得出， 乳酸及乙醇對L.panis 的乳酸合成具有較顯著影響。因此，為進(jìn)一步研究環(huán)境因素對L.panis 乳酸合成的影響，采用RT-qPCR 技術(shù)對L.panis 中乳酸合成相關(guān)基因（圖3）的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示。

酸是在食品和飲料發(fā)酵過程中由乳酸菌自身產(chǎn)生的重要環(huán)境壓力[16]。 添加乳酸可上調(diào)乳酸合成相關(guān)基因的表達(dá)，從而提高乳酸產(chǎn)量。

分別添加10 g/L 或 15 g/L 的乳酸后，L.panis中所有乳酸合成路徑中的相關(guān)基因的表達(dá)均出現(xiàn)顯著上調(diào)。 其中，編碼能催化丙酮酸生成乳酸的L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶的基因——ldhL 和ldhD 分別上調(diào)了 6.55 倍（10 g/L）和 7.57 倍（15 g/L）。研究表明，在酸性環(huán)境下，磷酸甘油酸激酶、磷酸丙酮酸水合酶和丙酮酸激酶等糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)會(huì)上調(diào)[17-18]，這與本研究的結(jié)果一致。 此外，本研究與Wu 等在L.casei 中所觀察到的現(xiàn)象一致，L.panis 中包括gapB、pgm 和 pgk 在內(nèi)的編碼葡萄糖代謝相關(guān)酶的基因表達(dá)的上調(diào)，表明酸性環(huán)境促進(jìn)的 L.panis 糖酵解代謝活性[18]。 而且 ldhL、 pk和gapB 的上調(diào)，可能會(huì)提高L.panis 在酸性環(huán)境下的存活率[19-20]。

乙醇是釀造微生物組的白酒釀造過程中的主要壓力因素之一。 研究表明，當(dāng)細(xì)胞直接受到體積分?jǐn)?shù)1.2%乙醇處理時(shí)， 蛋白質(zhì)的合成和穩(wěn)定性降低。 此外，在乙醇中，Oenococcus oeni 的碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)，與細(xì)胞壁和膜成分生物合成相關(guān)的基因被下調(diào)[21]。添加乙醇后，乳酸合成途徑中大多數(shù)基因的表達(dá)水平顯著下調(diào)，這表明在乙醇脅迫下，L.panis中心代謝途徑的代謝通量被下調(diào)。 與對照相比，添加體積分?jǐn)?shù) 2.0%乙醇后，ldhL 和ldhD 分別下調(diào)1.13 倍和2.48 倍。 但是，當(dāng)添加體積分?jǐn)?shù)4.0%的乙醇后，ldhL 卻上調(diào)了1.71 倍， 這可能與基因表達(dá)的時(shí)間特異性有關(guān)。 而且，乙醇脅迫下，乳酸產(chǎn)量減少后，編碼葡萄糖代謝酶的基因（如 gapB、pgk、pgm 和pyk）也受到了抑制，在克魯維酵母CCT 7735 中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[22]。 此外，ldhL 和 ldhD 的表達(dá)情況與乳酸產(chǎn)量的不一致也進(jìn)一步證實(shí)由丙酮酸生成乳酸的產(chǎn)量不會(huì)受到L-乳酸脫氫酶和D-乳酸脫氫酶表達(dá)的限制[23]。

圖3 葡萄糖為底物條件下L.panis 的乳酸代謝途徑Fig.3 Lactic acid metabolic pathways with glucose as substrate in L.panis

圖4 環(huán)境因素對L.panis 乳酸合成路徑相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.4 Effects of environmental factors on the expressionlevel of genes involved in the lactic acid pathway

3 結(jié) 語

作者揭示了釀造過程中不同環(huán)境條件對L.panis乳酸產(chǎn)量的影響，并進(jìn)一步對從醬香型白酒釀造微生物群落中分離出的L.panis 的乳酸合成關(guān)鍵基因的表達(dá)進(jìn)行了定量分析。 結(jié)果表明，添加乳酸能顯著上調(diào)L.panis 乳酸合成途徑的關(guān)鍵基因表達(dá)水平，且能促進(jìn)其乳酸的合成；而添加乙醇則會(huì)下調(diào)這些基因并抑制乳酸的合成。 明確影響乳酸合成的關(guān)鍵環(huán)境因素將為進(jìn)一步解析其乳酸代謝機(jī)制并且在發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)乳酸合成提供重要的指導(dǎo)。