章璐婷， 李瑾萌， 王一丁， 雍 彬， 謝 潔， 邵歡歡， 趙金星， 馬沁沁

（四川師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 610101）

據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球50%以上的死亡是缺血性心臟病等疾病引起的[1]。 研究表明，動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是缺血性心臟病的主要原因，而高膽固醇血癥是動脈粥樣硬化的致病因素[2]。據(jù)報道，血脂和膽固醇水平僅降低1%，患缺血性心臟病的風(fēng)險就可降低2%～3%[3]。 目前，主要的降血脂藥物有阿托伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀等。 這些藥物幾乎都有副作用，如便秘、腹痛、胃腸脹氣、過敏反應(yīng)綜合征等，且用藥成本較高[4-5]。 早在1970年，Mann 和Spoerry 就發(fā)現(xiàn)攝入用野生乳酸桿菌發(fā)酵的乳制品后，人體血清膽固醇水平降低[6]。 乳酸桿菌可以調(diào)節(jié)人體的胃腸道菌群，具有降低血脂和降低心血管疾病發(fā)病率的作用，且沒有副作用。

乳酸桿菌是一種通常被認為安全（generally recognized as safe，GRAS）的菌株[10]。 因此，尋找乳酸桿菌菌源并篩選出合適的菌種顯得尤為重要。 蜂糧是植物花粉、蜂蜜和蜜蜂唾液的發(fā)酵混合物，可食用。 蜜蜂采集的花粉與少量蜂蜜和唾液混合，在蜂巢中發(fā)生化學(xué)變化，形成具有營養(yǎng)價值的蜂糧產(chǎn)品[7]。 也有研究表明，乳酸桿菌廣泛分布于蜜蜂腸道，對蜂糧發(fā)酵起重要作用[8]。 蜂糧部分發(fā)酵，易被生物體吸收，因此具有更好的消化率和更豐富的化學(xué)成分，能補充人體缺乏的維生素，并有助于消除體內(nèi)各種毒素[9]。 因此，作者擬從蜂糧中分離篩選出具有優(yōu)良益生特性的降膽固醇乳酸桿菌菌株，為益生菌開發(fā)提供新的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 蜂糧蜂糧取自四川省成都市龍泉驛區(qū)同安鎮(zhèn)。

1.1.2 主要試劑鄰苯二甲醛、紅霉素、卡那霉素、萬古霉素、 諾氟沙星：Sigma-Aldrich 西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司產(chǎn)品；膽固醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司產(chǎn)品；牛膽鹽：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；冰醋酸、濃硫酸、無水乙醇、正己烷均為分析純：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；D3350-01 Bacterial DNA Kit：Omega Bio-Tek 公司產(chǎn)品；2×Taq Master mix：天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基MRS 肉湯、MRS 瓊脂、TSB 肉湯：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品；Iso-Sensitest 肉湯：賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；MRS-CHOL 培養(yǎng)基：0.1 g/L 膽固醇，0.24 g/L 牛膽鹽，0.12 g/L 蔗糖酯，1.2 mL/L 吐溫80，充分混勻后，用玻璃棒碾碎后加入5 mL/L 冰醋酸， 混合液40 ℃超聲處理20 min，0.45 μm 濾膜過濾處理后迅速加入1 L MRS 肉湯，同時迅速攪拌，形成均勻穩(wěn)定的膠體溶液[11]；MRSCaCO3固體培養(yǎng)基：MRS 瓊脂，2 g/dL CaCO3。

1.1.4 儀器與設(shè)備PowerCycler SL 96 Gradient PCR 自動系列分析儀：安捷倫科技（中國）有限公司產(chǎn)品；YZB/GER 1841-2014 臺式高速離心機： 賽默飛世爾（中國）有限公司產(chǎn)品；AR224CN 電子天平：奧豪斯儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；HZQ-211C 落地恒溫培養(yǎng)箱： 上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；Anoxomat MarkⅡ 厭氧培養(yǎng)裝置： 荷蘭MART 微生物公司產(chǎn)品；WD-12 氮吹儀：杭州奧盛儀器有限公司產(chǎn)品；WFJ7200 可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.5 菌株大腸埃希氏菌（Escherichia coli ATCC 25922）、 金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus ATCC 29213）： 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室饋贈。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌的分離與鑒定取蜂糧樣品25 g溶于200 mL 無菌生理鹽水，充分混勻，用無菌生理鹽水進行 10 倍梯度稀釋， 吸取 10-3、10-4稀釋液傾注于MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基中，充分混勻，37 ℃培養(yǎng)48 h。 挑取具有溶鈣圈的單菌落劃線于MRS 瓊脂上純化。 將3 次純化后的單菌落進行革蘭氏染色，觀察細胞特征，挑選革蘭氏陽性，桿狀菌株進行后續(xù)研究。 挑取單菌落接種于MRS 肉湯，加體積分?jǐn)?shù)50%甘油保存于-20 ℃。

將篩選得到的純菌株37 ℃培養(yǎng)48 h， 離心收集菌體細胞， 用D3350-01 E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit 提取細菌總 DNA。 用細菌通用引物 27F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′） 和 1492R （5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′） 擴增細菌 16S rRNA 基因， 擴增產(chǎn)物送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/） 進行 Blastn 比對。 基于 61 株菌株 16S rRNA 基因序列，用MEGA 6.06 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[12]，分別采用鄰接法 （neighbour-joining，NJ） 及最大似然 法 （maximum likelihood，ML）。 將 Lactobacillus plantarum（AP018405）[13]，Lactobacillus delbrueckii（CP 013610）[14]，Lactobacillus acidophilus （CP010432）[15]，Lactobacillus kunkeei （KX926549），Lactobacillus kunkeei（MG496059），Lactobacillus kunkeei（KY4968 52）作為參考菌株，將 Enterococcus faecalis （CP030 044）作為外類群。

1.2.2 鄰苯二甲醛法測定體外降膽固醇能力

1） 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 用無水乙醇配制質(zhì)量濃度為 0.1 g/L 的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液。 準(zhǔn)確吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 標(biāo)準(zhǔn)液于 25 mL 帶塞試管中， 加無水乙醇定容至1 mL。 加入4 mL 鄰苯二甲醛溶液，渦旋混勻，室溫靜置10 min 后加入2 mL 濃H2SO4，渦旋混勻， 室溫靜置10 min 待其顯色完全， 測定A550nm， 相同條件下不加膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液的樣品作為對照。

2）樣品處理和檢測 以體積分?jǐn)?shù)5%接種量接種0.5 麥?zhǔn)媳葷岫染鷳乙河?0 mL MRS-CHOL 培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r/min 震蕩， 培養(yǎng) 24 h 后， 取 1 mL 培養(yǎng)液，8 000 r/min 離心 5 min，取 0.5 mL 上清液于25 mL 帶塞試管中， 加質(zhì)量分?jǐn)?shù)50% KOH 溶液2 mL 及體積分?jǐn)?shù)95%無水乙醇3 mL， 渦旋混勻，60 ℃水浴 10 min 后立即冰水浴處理 5 min，同時加入5 mL 正己烷，渦旋混勻30 s，加入3 mL 蒸餾水，蓋上塞子，充分渦旋混勻。 取3 mL 正己烷于干凈的試管中，60 ℃ 氮氣吹干溶劑后， 加入4 mL鄰苯二甲醛溶液徹底混勻， 再加入2 mL 濃H2SO4溶液，立即渦旋混勻，室溫放置10 min 待反應(yīng)充分，再加入少量濃 H2SO4于 10～90 min 內(nèi)測定 A550nm。對照組接種同樣體積分?jǐn)?shù)的MRS 肉湯并做相同處理，每組 3 個平行[16]。

式中：C對照為未接種菌株的MRS-CHOL 培養(yǎng)基中膽固醇的質(zhì)量濃度，（μg/mL）；C樣品為發(fā)酵液上清液中膽固醇的質(zhì)量濃度，（μg/mL）。

篩選出具有膽固醇降解活性的菌株進行后續(xù)益生特性研究。

1.2.3 耐酸實驗將篩選的菌株傳代培養(yǎng)3 次，取37 ℃培養(yǎng) 48 h 后 1 mL 的發(fā)酵液 10 000 r/min 離心7 min，收集菌體，用pH 6.4 的無菌PBS 溶液洗滌兩次， 分別用 1 mL pH 為 2.0、3.0、6.4 的 PBS 進行重懸， 轉(zhuǎn)移至 9 mL 對應(yīng)酸度的 PBS 溶液中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在 0、1、2、3 h 取樣，采用平板計數(shù)法檢測活菌數(shù)，每組3 個平行[17]。

治療前、后4周空腹8 h以上檢測空腹血糖及餐后2 h血糖水平。臨床療效評價標(biāo)準(zhǔn)：顯效：通過相應(yīng)的治療，患者臨床癥狀得到顯著地改善，肺功能明顯提升；有效：經(jīng)過治療，患者臨床癥狀有一定程度的緩解，肺功能有所提升；無效：治療之后，患者臨床癥狀并未改善或者加重，肺功能無變化或者降低。總有效率=顯效率+有效率。

式中：Mt為所篩菌株經(jīng)過 pH 為 2.0 或 3.0 的 MRS肉湯分別處理 0、1、2、3 h 后的活菌數(shù)；M0為所篩菌株經(jīng)過 pH＝6.4 的 MRS 肉湯分別處理 0、1、2、3 h 后的活菌數(shù)。

1.2.4 膽鹽耐受實驗以體積分?jǐn)?shù)10%接種量接種0.5 麥?zhǔn)媳葷岫染鷳乙河谫|(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%膽鹽，pH 3.0 的 MRS 肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)[3]。 分別在0、3、5 h 取樣，采用平板計數(shù)法檢測活菌數(shù)，每組3個平行[18，9]。

式中：Nt為所篩菌株經(jīng)過pH 3、 膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的 MRS 肉湯處理 3、5 h 后的活菌數(shù)；N0為所篩菌株經(jīng)過pH 3、膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的MRS 肉湯處理0 h 后的活菌數(shù)[20]。

1.2.5 微量肉湯法測定L.kunkeei 菌株最低抑菌濃度先在無菌96 孔板第1—11 列孔中加入100 μL無菌Iso-Sensitest 肉湯培養(yǎng)基， 然后在第1 列孔中加入質(zhì)量濃度為16 μg/mL 的抗生素溶液100 μL，逐次倍比稀釋至第11 列 （終質(zhì)量濃度分別為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg/mL）， 每孔抗生素終體積為100 μL。 每孔依次加入 0.5 麥?zhǔn)媳葷岫染鷳乙?00 μL， 使終體積為 200 μL。 以 200 μL/孔的無菌ISO 肉湯作為陰性對照，200 μL/孔菌液作為陽性對照，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，用酶標(biāo)儀檢測A600nm（每組3個平行）[21]。測量結(jié)果根據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會 （clinical and laboratory standards institute，CLSI）頒布的 《乳酸菌種類-微量肉湯稀釋法敏感性試驗信息及解釋標(biāo)準(zhǔn)》[22]判定和分析。

1.2.6 瓊脂擴散法測定乳酸桿菌抑菌特性挑取菌斑，接種于 5 mL MRS 肉湯，37 ℃、120 r/min 搖床培養(yǎng)48 h。 取乳酸桿菌發(fā)酵液10 000 r/min 離心10 min 得上清液，將上清液立即過濾（0.22 μm）除菌體細胞，4 ℃冷藏待用。 以體積分?jǐn)?shù)0.1%接種量分 別 將 大 腸 埈 希 氏 菌 （Escherichia coli）ATCC 25922、 金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus aureus）ATCC 29213 與LB 瓊脂混勻后傾倒于平皿中待凝，平皿中事先放好已滅菌的牛津杯， 待瓊脂凝固后，輕輕取出牛津杯在形成的瓊脂孔中分別加入100 μL 除菌后的發(fā)酵上清液，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的直徑（mm），每組 3 個平行[18，23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA 基因同源性鑒定

將測序結(jié)果進行Blastn 比對，61 株菌株的部分16S rRNA 基因序列與Lactobacillus kunkeei 的 16S rRNA 序列的同源性達到99%以上。 通過NJ 及ML算法構(gòu)建的菌株系統(tǒng)進化樹拓撲結(jié)構(gòu)基本一致。 如圖1 所示，ML 樹顯示所有菌株均屬同一類群，均為Lactobacillus kunkeei。作為蜜蜂常見的有機共生體，L.kunkeei 是最主要的乳酸桿菌菌種， 也是蜂房花粉的優(yōu)勢菌種[27]，能夠特異性附著于上皮細胞表面[28-29]。 本研究中蜂糧樣品采自夏季，可能是分離菌種單一的主要原因。

圖1 61 株L.kunkeei 的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of 61 L.kunkeei strains

2.2 體外降膽固醇活性分析

高膽固醇血癥是目前威脅人類健康的重大問題， 乳酸桿菌具有去除膽固醇和降低血脂的作用。通過鄰苯二甲醛法檢測61 株L.kunkeei 的膽固醇去除能力， 發(fā)現(xiàn)其中 5 株菌（B6，B23，B28，B35，B45）膽固醇去除率為 15.87%～29.07%（圖2），B6 和B35、B45 對降膽固醇的去除率均高于25%， 其中B35 去除膽固醇的能力最強，達到（29.07±1.30）%，該結(jié)果優(yōu)于Ley 和Bosch 等在相同條件下檢測的L.bulagaricus 和 L.plantarum 的降解率[30-31]。 該結(jié)果表明，B35 菌株具有較高的膽固醇降解作用，但目前降解機制尚不明確，有待進一步研究。

2.3 耐酸特性研究分析

篩選作為益生菌的乳酸桿菌前提條件是能在一定時間內(nèi)耐受胃液的酸度，人體胃液的酸度主要隨飲食結(jié)構(gòu)的變化而變化， 空腹?fàn)顟B(tài)下胃液pH 值為0.8～0.9，進食過程中，pH 值范圍變化較大，達到1.8～5.0，通常情況維持在3.0，食物在胃中停留時間一般為 1～3 h[32]。 當(dāng)用 pH 3.0 的 PBS 處理 3 h 后，5株L.kunkeei 均表現(xiàn)為生長，存活率分別為（72.55±0.11）%、（77.70±0.15）%、（81.39±0.33）%、（84.59±0.12）%、（88.43±0.15）%（圖3）。 說明 5 株 L.kunkeei都能很好地耐受胃液的酸性條件。 該結(jié)果優(yōu)于Tulumoglu 等從Tulum 奶酪中分離的植物乳酸桿菌對酸性條件的耐受[17]。 當(dāng)用pH=2 的PBS 緩沖液處理 3 h 后， 除B35 外， 其余菌株存活率顯著降低（P＜0.05）。 B35 在 3 h 后的存活率達到 （35.71±0.11）%。 實驗結(jié)果表明，5 株 L.kunkeei 能耐受餐后胃環(huán)境的酸度，順利進入腸道，發(fā)揮益生功能，其中B35 的耐酸能力最強。

圖2 5 株 L.kunkeei 膽固醇去除率（n=3）Fig.2 Cholesterol assimilation rate of 5 strains of L.kunkeei（n=3）

圖3 在酸性條件下5 株L.kunkeei 的存活率Fig.3 Survival rate of 5 L.kunkeei strains under acidic condition

2.4 膽鹽耐受性分析

在生物體內(nèi)，膽鹽作為一種生物清潔劑，通過其乳化和水解脂質(zhì)的能力使其在脂肪的消化中起著十分重要的作用[33]，是否能在一定時間內(nèi)耐受高膽鹽濃度是作為益生菌的乳酸桿菌在腸道中生存和增殖的前提條件[31]。 以在酸性（pH 3.0）厭氧條件，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.3%的膽鹽條件下菌株存活率評價菌株膽鹽耐活性。 如圖4 所示，所篩選的5 株菌都具有一定膽鹽耐受能力。 在此高膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下處理5 h 后，5 株菌的存活率菌均超過50%，其中B35 存活率達到（57.27±2.30）%，這與 Anandharaj 的結(jié)果相近[3]。說明所篩選的5 株L.kunkeei 能夠在小腸內(nèi)存活并發(fā)揮益生性能。

2.5 抗生素耐受性分析

圖4 5 株 L.kunkeei 的膽鹽耐受性（n=3）Fig.4 Bile salt tolerance of 5 strains of L.kunkeei（n=3）

備選益生菌的菌株首要要求是對人體絕對安全，不能具有潛在可轉(zhuǎn)移的抗生素耐藥基因[34]。根據(jù)CLSI 《乳酸菌種類-微量肉湯稀釋法敏感性試驗信息及解釋標(biāo)準(zhǔn)》[22]，5 株菌對4 種臨床常用抗生素都高度敏感（表1）。 乳酸桿菌通常被認為對萬古霉素有耐藥性[35]，而本研究中所有菌株均對萬古霉素敏感。所有菌株分離于四川地區(qū)的蜂糧，F(xiàn)ei-li Xu 等[36]及Qinqin Ma[37]等分別在我國市售乳制品和四川地區(qū)泡菜中發(fā)現(xiàn)對萬古霉素敏感的乳酸桿菌。 這可能是由于地區(qū)特異性造成的，其原因尚不明確。 上述結(jié)果表明，5 株L.kunkeei 對受試抗生素敏感，攜帶相應(yīng)耐藥基因風(fēng)險很低，可作為益生菌菌種使用。

表1 5 株L.kunkeei 對抗生素的最低抑菌質(zhì)量濃度Table 1 Minimum inhibitory concentration of antibiotics for 5 L.kunkeei strains

2.6 抑菌活性分析

以抑菌圈直徑評價L.kunkeei 抑菌活性， 結(jié)果見表2。 5 株L.kunkeei 發(fā)酵液對常見革蘭氏陰性（E.coli，ATCC 25922） 和 革 蘭 氏 陽 性 病原 菌 （S.aureus，ATCC 29213） 的生長均有不同程度的抑制。B6、B23、B28 及 B35 對 E.coli 及 S.aureus 抑菌作用效果無顯著性差異（P＞0.05），而B45 的抑菌能力偏弱（P＜0.05）。 B6、B23、B28 及 B35 發(fā)酵液有廣譜抑菌性，這與陳秀金等人的研究結(jié)果一致[38]。這4 株L.kunkeei 具有良好的抑菌活性， 可以在腸道內(nèi)抑制致病菌的生長，具備構(gòu)建健康的腸道菌群，調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境的潛力。

表2 5 株L.kunkeei 對常見致病菌抑菌活性（n=3）Table 2 Bacteriostatic activities of 5 L.kunkeei strains to E.coli and S.aureus (n=3)

2.7 Caco-2 細胞黏附特性

選擇膽固醇降解能力及對酸與膽鹽耐受性都最強的B35 進行體外黏附Caco-2 細胞能力的測定。 B35 的初始濃度 1.616×108CFU/mL。 與 Caco-2細胞作用后，B35 的濃度分別為5.36×106CFU/mL。B35 的黏附率為3.32%，與占萌等[24]對乳酸桿菌的黏附性測定結(jié)果相比較，B35 的黏附性低于商用嗜酸乳桿菌NCFM 的黏附性，但明顯高于鼠李糖乳桿菌。 表明B35 可在腸道定殖，且不會由于長期定植而造成腸道微生物系統(tǒng)的紊亂。

3 結(jié) 語

作者自蜂糧種分離到61 株菌株，從中篩選到5株具有較強降解膽固醇能力的菌株，其中B35 菌株降膽固醇能力最強。 乳酸桿菌進入腸道需經(jīng)過胃的低pH 環(huán)境和腸道的高膽鹽環(huán)境，通過對酸耐受、膽鹽耐受、抗生素耐受、抑菌活性等益生特性的檢測，發(fā)現(xiàn)B35 菌株性能最佳，可作為良好的益生菌菌種資源。 下一步將對B35 進行體內(nèi)實驗，探索其在體內(nèi)的降解膽固醇效果，并對其降解膽固醇的機制進行進一步研究。