周景文 ， 高 松 ， 劉延峰 ， 李江華 ， 堵國成 ， 陳 堅 *

（1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

發(fā)酵工業(yè)是我國生物產(chǎn)業(yè)和輕工業(yè)的重要組成部分，其直接生產(chǎn)的產(chǎn)品包括酶制劑、有機酸、氨基酸、酒和乙醇等，產(chǎn)值約1.5 萬億，與其密切相關(guān)的產(chǎn)品包括抗生素、維生素、基因工程藥物等，產(chǎn)值達到 3～5 萬億。

在21 世紀前， 發(fā)酵工程技術(shù)的發(fā)展經(jīng)歷了以生產(chǎn)食品等生活資料為主的自然發(fā)酵過程到以生產(chǎn)生活資料和工業(yè)基礎(chǔ)資料并重的代謝控制發(fā)酵過程的轉(zhuǎn)變。 20 世紀末和21 世紀前20 年，由于與發(fā)酵工程技術(shù)密切相關(guān)的生命科學(xué)、化學(xué)工程和控制工程技術(shù)等在理論、方法乃至知識體系方面的快速發(fā)展，發(fā)酵工程技術(shù)的一些重要部分和核心內(nèi)涵受其影響也發(fā)生了變化。 典型的例子包括：1）傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)中的發(fā)酵微生物菌株改良。 主要內(nèi)容包括微生物選擇性分離、誘變育種等，被發(fā)酵微生物細胞工廠構(gòu)建和改進的思想和方法替代[1]，而后者主要是基于先進的高通量篩選技術(shù)[2]、基因快速編輯[3]和DNA 組裝方法[4]，以及細胞系統(tǒng)改造與精準調(diào)控[5]等等。 2）傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)中的發(fā)酵工藝和條件優(yōu)化。 以搖瓶培養(yǎng)確定培養(yǎng)基組成、臺式發(fā)酵罐確定發(fā)酵初始條件等為主要內(nèi)容，被發(fā)酵過程優(yōu)化[6]和動態(tài)控制[7]的思想和方法改變，趨向微小型反應(yīng)器模擬與組合優(yōu)化技術(shù)[8]、發(fā)酵過程在線監(jiān)測和實時控制技術(shù)[9]、發(fā)酵產(chǎn)品聯(lián)產(chǎn)技術(shù)[10]以及傳統(tǒng)發(fā)酵的流程重構(gòu)技術(shù)等。 作者在闡述發(fā)酵工程技術(shù)發(fā)展歷程的基礎(chǔ)上，重點介紹新一代發(fā)酵工程技術(shù)的一些典型內(nèi)容， 給出了發(fā)酵工程技術(shù)4 個最新的發(fā)展案例，供相關(guān)人員參考。

1 發(fā)酵工程的發(fā)展歷程

發(fā)酵工程技術(shù)的核心是微生物。 微生物具有種類繁多、代謝途徑復(fù)雜多樣、代謝強度大、生長周期短、適應(yīng)性強等特點。 微生物種類繁多，代謝途徑復(fù)雜多樣，為生產(chǎn)各種產(chǎn)物提供了可能；代謝強度大、生長周期短， 可以在短時間將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品；適應(yīng)強，可以適應(yīng)各種嚴苛環(huán)境，對發(fā)酵控制和場地要求低，可以實現(xiàn)低成本全天候生產(chǎn)。

一般認為，發(fā)酵工程的發(fā)展，包括以下幾個階段，即：天然發(fā)酵階段（公元前至公元1680 年）、純培養(yǎng)發(fā)酵階段（1680 年至1928 年，以顯微鏡的發(fā)現(xiàn)作為分界）、深層發(fā)酵技術(shù)階段（1928 年后，青霉素的發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵）、 現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)階段（1980 年后，基因工程的出現(xiàn)和工業(yè)應(yīng)用），新一代發(fā)酵工程技術(shù)（2000 年后，合成生物學(xué)和信息技術(shù)的整合與應(yīng)用）。 發(fā)展歷程見圖1。

1.1 天然發(fā)酵階段

大量的考古研究發(fā)現(xiàn)， 在有文字記錄以前，人類就開始利用天然微生物生產(chǎn)多種發(fā)酵產(chǎn)品，如各種乙醇飲料、發(fā)酵面包制品等[11-12]。 在人類歷史的大部分時期，人類并不知道微生物的存在和發(fā)酵的原理，一般直接采用自然界的微生物，完全依靠經(jīng)驗進行生產(chǎn)。 在這種情況下，通常存在發(fā)酵失敗率高、產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊等問題。 由于無菌操作認識的限制，這一時期多為厭氧發(fā)酵。 厭氧發(fā)酵可以產(chǎn)生乙醇、乳酸等物質(zhì)，抑制部分有害微生物，從而提高發(fā)酵成功率。 隨著經(jīng)驗的積累，人們開始有意識地選擇和保存優(yōu)良的發(fā)酵菌曲， 并對發(fā)酵過程進行控制，建立了加熱、密封等原始的消毒和滅菌操作。 在這一階段后期， 發(fā)酵產(chǎn)品的種類開始豐富起來，如黃酒、啤酒、葡萄酒、面包、酸奶、醋、酸菜、腐乳等，改善了人類的生活水平和營養(yǎng)狀況。

圖1 發(fā)酵工程發(fā)展歷程Fig.1 History of fermentation engineering

1.2 純種發(fā)酵階段

雖然經(jīng)歷了長期的積累，但是發(fā)酵過程的穩(wěn)定性和可控性一直是一個難題。 顯微鏡的發(fā)明使得人們可以直接觀察到微生物。 在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們揭開了發(fā)酵過程的原理。 在對微生物的研究過程中，建立了菌種分離純化技術(shù)和無菌操作技術(shù)。 人類從依賴經(jīng)驗的天然發(fā)酵階段，進入到純種發(fā)酵階段。 基于純種發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程的穩(wěn)定性和可控性得到了極大的增強。 發(fā)酵產(chǎn)品的種類和數(shù)量也得到進一步提升，除了發(fā)酵食品外，丙酮、丁醇[13]、乙醇[14]等工業(yè)產(chǎn)品的發(fā)酵也逐步建立起來，使得發(fā)酵工程逐步從以生產(chǎn)食品等生活資料為主的自然發(fā)酵過程，轉(zhuǎn)變?yōu)橐陨a(chǎn)生活資料和工業(yè)基礎(chǔ)資料并重的代謝控制發(fā)酵過程。 在這一階段時期，積累了大量的關(guān)于發(fā)酵微生物的生長代謝性質(zhì)， 如最佳接種量、最佳接種時期、最佳pH、最佳溫度、最佳培養(yǎng)基、副產(chǎn)物積累以及菌體生長和產(chǎn)物積累的相互作用等。 通過收集和分析數(shù)據(jù)，進一步用于指導(dǎo)優(yōu)化發(fā)酵過程。 在此階段開發(fā)和應(yīng)用了一系列的監(jiān)測和反饋元件，顯著提升了發(fā)酵效率。

1.3 深層發(fā)酵階段

雖然厭氧發(fā)酵成功生產(chǎn)了大量的工業(yè)產(chǎn)品，但是由于厭氧微生物一般較好氧微生物生長緩慢，并且積累非必需的副產(chǎn)物，好氧微生物開始進入到人們的視野。 隨著菌種純化、保存和無菌操作技術(shù)的快速發(fā)展， 好氧微生物的發(fā)酵培養(yǎng)不再容易染菌，而且好氧微生物可以生產(chǎn)更加豐富的產(chǎn)品。 由于青霉素的巨大需求，基于青霉素發(fā)酵的好氧發(fā)酵技術(shù)快速發(fā)展， 建立了好氧性發(fā)酵通氣攪拌工程技術(shù)，結(jié)合無菌空氣過濾技術(shù)，相關(guān)的抗生素發(fā)酵產(chǎn)品產(chǎn)能迅速擴大[15]。 由抗生素發(fā)酵而積累的深層好氧發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展和成熟，逐步普及到其他好氧微生物的發(fā)酵和產(chǎn)物合成，更多的產(chǎn)品可以通過好氧發(fā)酵得到，如丙酮酸、酮戊二酸、維生素C、氨基酸等[2]，并出現(xiàn)了以酶制劑為代表的蛋白質(zhì)產(chǎn)品， 如蛋白酶、角蛋白酶和淀粉酶等[16-17]。 深層發(fā)酵技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，帶動了微生物學(xué)、生物化學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和基因工程等發(fā)酵工程支撐學(xué)科的迅速融合，同時越來越多的發(fā)酵策略和檢測控制元件被開發(fā)和應(yīng)用在發(fā)酵過程中。 此時，發(fā)酵工程進入到第三階段的鼎盛時期。

2 現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)

20 世紀80 年代后， 基因工程技術(shù)的出現(xiàn)推進了其他學(xué)科的迅速發(fā)展，國際和國內(nèi)發(fā)酵工程進入到現(xiàn)代發(fā)酵工程階段。 發(fā)酵工程根據(jù)生產(chǎn)流程，被劃分為上游、中游和下游工程3 部分。 上游工程主要為菌種的選育和改造，以期獲得生產(chǎn)性能良好的菌株。 中游工程主要為發(fā)酵過程控制，通過對發(fā)酵過程中各種參數(shù)的采集、分析和反饋，獲得產(chǎn)品積累的最佳發(fā)酵條件。 下游工程主要是對產(chǎn)品的分離和純化，采用多種技術(shù)將發(fā)酵產(chǎn)品從發(fā)酵液或者細胞中分離、純化出來，達到指標后制成產(chǎn)品，最終進入消費市場（圖2）。

圖2 現(xiàn)代發(fā)酵工藝的組成Fig.2 Constitution of modern fermentation technology

2.1 菌種選育

在天然發(fā)酵初期，發(fā)酵都是使用從自然界中篩選獲得原始菌株，一般僅用于食品發(fā)酵。 自然界中獲得的菌種一般生產(chǎn)強度低， 工業(yè)化成本較高，不適合大規(guī)模、高強度生產(chǎn)種類眾多的目標產(chǎn)品。 由于對微生物的了解甚少，天然發(fā)酵階段的菌種篩選只能基于經(jīng)驗，人工選擇菌曲進行保存和傳代。 進入純種發(fā)酵階段后，隨著對微生物的認識越來越深入，基于原始菌株進行壓力篩選和人工誘變等定向進化策略，挑選生產(chǎn)性能提高的菌株，獲得了大量高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)菌株，相關(guān)產(chǎn)品的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了質(zhì)的飛躍。 在深層發(fā)酵階段，大量菌體初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物被大量合成，如丙酮、丁醇、乙醇和各類抗生素等。

20 世紀70 年代以后， 隨著基因工程技術(shù)和其他支撐學(xué)科的融合發(fā)展，在基因水平對發(fā)酵菌株進行改造成為可能。 基于基因工程，可以導(dǎo)入外源基因，生產(chǎn)菌種原來并不生產(chǎn)的物質(zhì)，如胰島素等[18]?；诨蚬こ桃部梢詫w本身的基因或者途徑進行強化或弱化， 改變菌體的物質(zhì)流和能量流，向著提高產(chǎn)品的通路流動，如對谷氨酸棒狀桿菌進行改造， 可以獲得積累L-谷氨酸、L-賴氨酸、L-蘇氨酸的菌株[19]。 基于基因工程甚至可以改變菌體的生理性狀，使得菌株的耐受性獲得改善，產(chǎn)品利于分離，降低中游和下游的操作難度和成本，如α-酮戊二酸耐酸菌種的構(gòu)建，可以有效提高α-酮戊二酸的積累，降低了中游發(fā)酵難度和下游分離成本[20]?，F(xiàn)代菌種構(gòu)建技術(shù)結(jié)合飛速發(fā)展的高通量測序技術(shù)、生物信息學(xué)技術(shù)、高分辨率質(zhì)譜和核磁技術(shù)、同位素標記技術(shù)、高分辨率電鏡技術(shù)等，可以方便快捷對菌種的各項性能進行快速鑒定，進而指導(dǎo)對菌株的理性改造，獲得性能更加優(yōu)異的菌種。

2.2 過程控制

發(fā)酵反應(yīng)的重要場所是發(fā)酵罐，發(fā)酵過程控制主要基于發(fā)酵罐進行。 發(fā)酵罐一般具有管路系統(tǒng)（空氣、物料輸入輸出、溫控管路等）、攪拌系統(tǒng)（攪拌槳、攪拌軸和電機等）、檢測系統(tǒng)（溫度、pH、溶解氧、 甲醇體積分數(shù)等）、 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)和反饋系統(tǒng)（蠕動泵，加熱模塊、電機等）等。 圖3 為一個典型的發(fā)酵系統(tǒng)示意圖。

發(fā)酵過程控制系統(tǒng)包括數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)、數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)和反饋操作系統(tǒng)。數(shù)據(jù)的采集包括溫度、pH、溶氧、OD 值、轉(zhuǎn)速、壓強以及銨離子、金屬鹽離子、甲醇、葡萄糖、乳酸、谷氨酸、乙醇等含量。 加裝尾氣檢測裝置后，可以分析尾氣中水分、氧氣、二氧化碳等濃度。 數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)可以直接用于反饋操作系統(tǒng)，也可以對初級數(shù)據(jù)進行加工獲得次級數(shù)據(jù)，如比生長速率等，然后再用于反饋操作系統(tǒng)。 反饋操作系統(tǒng)根據(jù)獲得的數(shù)據(jù)，對發(fā)酵條件進行在線調(diào)整，如調(diào)節(jié)溫度、轉(zhuǎn)速、流加速度和通氣流量等，以維持發(fā)酵條件處在最佳狀態(tài)，提高產(chǎn)物的積累量。 多年來，發(fā)酵過程控制也逐漸由簡單控制向智能控制轉(zhuǎn)變，發(fā)展出了諸如模糊控制等復(fù)雜的發(fā)酵控制策略[21]。

2.3 分離技術(shù)

對發(fā)酵液中產(chǎn)品的分離純化，占到整個發(fā)酵成本的20%以上，并且直接影響產(chǎn)品的質(zhì)量。 將產(chǎn)品從發(fā)酵液或者細胞中分離出來， 一般包括破碎、離心、過濾、萃取、色譜分離、膜分離、濃縮、結(jié)晶、干燥、制劑等步驟。 根據(jù)不同的產(chǎn)品，會選用不同的分離流程。 隨著材料科學(xué)的不斷發(fā)展，產(chǎn)品分離越來越依賴于高性能材料，如使用不同的高分子材料制成的半透膜以及色譜填料等。

圖3 典型發(fā)酵罐系統(tǒng)示意圖Fig.3 Typical bioreactor system

2.4 發(fā)酵工程對其他行業(yè)的支撐作用

現(xiàn)代發(fā)酵工程技術(shù)已經(jīng)和眾多行業(yè)深度交叉整合，產(chǎn)生了巨大的社會和經(jīng)濟效益。

2.4.1 醫(yī)藥行業(yè)醫(yī)藥行業(yè)是發(fā)酵工程技術(shù)應(yīng)用最為廣泛的領(lǐng)域。據(jù)統(tǒng)計，60%以上的生物技術(shù)運用于醫(yī)藥衛(wèi)生方面。 正是由于對抗生素的巨大需求，直接推動了有氧發(fā)酵技術(shù)的快速發(fā)展和完善，發(fā)酵工程進入到深層發(fā)酵階段。 基因工程的興起，使得發(fā)酵工程可以用于生產(chǎn)更多抗生素、藥品、補充劑等。 基因工程的深度介入，發(fā)酵工程也被用于生產(chǎn)生物活性物質(zhì)，如胰島素、疫苗、單克隆抗體、激素等[22-23]。

2.4.2 食品工業(yè)基于發(fā)酵工程選育高品質(zhì)菌株，結(jié)合發(fā)酵控制技術(shù)，可以獲得品質(zhì)提升顯著的發(fā)酵食品，同時降低生產(chǎn)成本[24]。天冬酰胺酶可以降解丙烯酰胺，用于油炸類食品，可以提高油炸食品的安全性[25]。通過定向進化和分子機制解析，調(diào)控黃酒酵母的氮代謝阻遏，可以有效降低有害物質(zhì)氨基甲酸乙酯在黃酒中的積累[26]。 發(fā)酵生產(chǎn)蛋白酶和半乳糖酶，可以減少乳制品中的過敏原[27]。發(fā)酵工程也為食品行業(yè)提供了大量的食品添加劑，如維生素C、檸檬酸[28]、天然色素[29]等。

2.4.3 農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)農(nóng)業(yè)為發(fā)酵工業(yè)提供了大部分原料，如淀粉、糖蜜、豆粕、纖維素等，這些都直接來自農(nóng)副產(chǎn)品。 同時，發(fā)酵工業(yè)產(chǎn)品也大量應(yīng)用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)。抗生素，如金霉素、土霉素等[30]；飼料添加酶制劑，如果膠酶[31]、木聚糖酶[32]、植酸酶等；生長激素，如赤霉素[33]、脫落酸[34]等；營養(yǎng)補充劑，如維生素C[35]、維生素B2、各種氨基酸等；生物防治害蟲技術(shù)，如蘇云金芽孢桿菌可用于殺滅害蟲[36]、阿維菌素可用于治療線蟲類疾病等[37]。

2.4.4 能源與材料隨著化石能源的枯竭和對環(huán)境的污染，生物能源逐漸進入人們的視野。 利用玉米、甘蔗、木薯等淀粉發(fā)酵生產(chǎn)的生物乙醇，可以有效解決生產(chǎn)過剩和庫存過剩。 目前，多家公司開發(fā)了纖維素酶或者產(chǎn)纖維素酶菌株用于發(fā)酵，可以利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)新一代生物乙醇，進一步擴大了生物能源的范圍[38]。除了利用廢棄木料外，開發(fā)藻類等自養(yǎng)型微生物進行固碳[39]，生產(chǎn)微藻能源，也是生物能源的重點領(lǐng)域。 利用發(fā)酵工程也為各種新材料提供了原料，如發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丙酸用于合成高聚物等[40]。

2.4.5 紡織、 造紙與皮革工業(yè)在傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)中，紡織、造紙與皮革產(chǎn)業(yè)歷來都是高能耗與高排放的行業(yè)，需進行技術(shù)升級以實現(xiàn)節(jié)能減排。 通過發(fā)酵法生產(chǎn)角質(zhì)酶、果膠酶、聚乙烯醇酶和過氧化氫酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)的熱堿工藝除去天然纖維的蠟質(zhì)層，可實現(xiàn)能耗減少43%、水耗減少32%、成本減少41%[41]。 使用發(fā)酵生產(chǎn)的脂肪酶、角蛋白酶甚至可以完全替代皮革工業(yè)中化學(xué)品的應(yīng)用[42]。 紡織等工業(yè)產(chǎn)生的廢水也可以使用過氧化氫酶、漆酶進行處理[43]。

2.4.6 日化行業(yè)早期只有一些簡單的發(fā)酵產(chǎn)品用于日化行業(yè)， 如在洗衣粉中添加蛋白酶和脂肪酶。 隨后一些可以用于人體護理的發(fā)酵產(chǎn)品開始用于日化產(chǎn)品的添加，如用于保濕的透明質(zhì)酸[44]、小核菌膠[45]。 一些具有美白和香氛作用的小分子也陸續(xù)使用發(fā)酵法替代了原始的植物提取，如熊果苷[45]、人參皂苷[46]、苯乙醇[47]等。還有添加了益生菌的牙膏[48]，有助于維護口腔健康。

2.4.7 環(huán)境生態(tài)近年來，隨著人類生活水平的提高，人們對生態(tài)環(huán)境的重視與日俱增。 發(fā)酵工程技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于環(huán)境生態(tài)的改良和改善中，取得了良好的效果。 除了開發(fā)生物質(zhì)能源降低使用化石燃料對環(huán)境的碳排放、使用酶制劑降解紡織業(yè)的工業(yè)廢水外，發(fā)酵工業(yè)在土壤重金屬富集[49]、塑料制品降解[50]、生物基可降解塑料[40]等方面也應(yīng)用廣泛。

3 發(fā)酵工程技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)和發(fā)展趨勢

3.1 發(fā)酵工程技術(shù)與新能源

自從工業(yè)革命以來，人類對不可再生化石燃料的大量開發(fā)與使用，導(dǎo)致全球污染、氣候異常越來越常見，嚴重威脅了人類的生存。 同時，化石燃料資源儲備減少，開采難度增加，開采成本提高。 因此，環(huán)境友好型的新能源越來越成為重點研究領(lǐng)域。

生物技術(shù)在新能源的開發(fā)上有兩個重要方向。一是拓寬生物基能源來源。 利用存儲量巨大但是難以降解的生物基，如纖維素、半纖維素等作為發(fā)酵底物，生產(chǎn)生物乙醇。 纖維素和半纖維在環(huán)境中存儲量巨大，木材、甘蔗渣、樹葉等基質(zhì)中，纖維素約占質(zhì)量分數(shù)40%～50%， 半纖維素約占10%～30%。然而由于纖維素難以降解，一般只能丟棄或者簡單燃燒，利用率低。 采用發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)纖維素酶和半纖維素酶，可以直接降解和利用這些難以利用的生物基質(zhì)生產(chǎn)生物乙醇。 也可以設(shè)計可降解纖維的工程菌株，直接降解纖維素生產(chǎn)生物乙醇[51]。二是通過構(gòu)建和改造自養(yǎng)型微生物直接利用太陽能。 工程改造后的自養(yǎng)型微生物可以高效利用太陽能，固定環(huán)境中的二氧化碳，生產(chǎn)單菌體蛋白[52]?；蛘咭宰责B(yǎng)型生物為底盤生物，構(gòu)建生物合成途徑，直接利用太陽能合成產(chǎn)品，從而降低對化石能源的需求[53-54]。

3.2 發(fā)酵工程支撐技術(shù)的發(fā)展

發(fā)酵工程從天然發(fā)酵階段到現(xiàn)代發(fā)酵階段，從全憑經(jīng)驗到理性設(shè)計， 從單純的食品發(fā)酵到醫(yī)藥、農(nóng)牧、能源、材料、紡織、日化、生態(tài)等眾多行業(yè)的應(yīng)用和延伸，是多種技術(shù)相互支撐和交叉的結(jié)果。 發(fā)酵工程已經(jīng)成為一門多學(xué)科交叉的新學(xué)科，涵蓋了微生物學(xué)、生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、遺傳學(xué)等幾乎所有與生命科學(xué)相關(guān)的學(xué)科。 在此基礎(chǔ)上，還受到包括分子生物學(xué)、免疫生物學(xué)、人體生理學(xué)、動物生理學(xué)、微生物生理學(xué)、植物生理學(xué)等次級學(xué)科支撐，以及化學(xué)、數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)、信息學(xué)、微電子學(xué)等多學(xué)科的輔助。 但是發(fā)酵工程依然有眾多關(guān)鍵核心技術(shù)亟待解決，包括：1） “組學(xué)”技術(shù)。包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等多種組學(xué)技術(shù)的結(jié)合與應(yīng)用；2） 合成生物學(xué)技術(shù)。 合成生物學(xué)技術(shù)即引進工程化概念，結(jié)合微生物學(xué)、分子生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、遺傳工程、材料科學(xué)以及計算機科學(xué)等多學(xué)科， 實現(xiàn)從元件到模塊再到系統(tǒng)的“自下而上”的設(shè)計。 其中，高通量、低成本DNA 合成技術(shù)和超長基因片段的高效重組技術(shù)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析、定向設(shè)計與合成技術(shù)、標準化生物元件與功能模塊的構(gòu)建技術(shù)是合成生物學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵；3） 生物信息技術(shù)。 生物信息技術(shù)是以計算機為工具對生物信息進行儲存、檢索和分析的技術(shù)[55]。基于信息技術(shù)的人工智能也快速應(yīng)用到發(fā)酵過程控制、結(jié)果計算和分析反饋中，為快速優(yōu)化發(fā)酵過程提供了技術(shù)支持[56]，推動發(fā)酵工程朝著集約化和智能化方向發(fā)展；4） 先進材料技術(shù)。 發(fā)酵工程的發(fā)展也對材料提出了新的要求， 如分離效果更好的填料、半透性更專一的膜分離材料、高疏水材料、耐酸耐腐蝕的材料等。 先進材料的應(yīng)用，主要提高了發(fā)酵過程的穩(wěn)定性、精確度和產(chǎn)品分離的效率。

3.3 發(fā)酵工程技術(shù)趨勢

3.3.1 通過平衡還原力使好氧發(fā)酵轉(zhuǎn)厭氧發(fā)酵目前好氧發(fā)酵占據(jù)主流發(fā)酵地位，但是好氧發(fā)酵中相當多的能量進入TCA 循環(huán)消耗掉，同時也有相當一部分物質(zhì)用于細胞合成，這部分能量和物質(zhì)都未進入產(chǎn)品生產(chǎn)， 降低了物質(zhì)利用效率和產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率。 厭氧發(fā)酵中，TCA 循環(huán)基本沒有活性，經(jīng)由TCA循環(huán)消耗的能量較少；厭氧發(fā)酵中，細胞量較少，進入細胞合成的物質(zhì)流較少，因而底物利用率和產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率較高。 但是微生物經(jīng)由厭氧發(fā)酵時由于不經(jīng)過TCA 循環(huán)，細胞幾乎不利用氧氣，容易造成還原力無法循環(huán)而失衡，阻礙菌體生長。 通過引入新的途徑，可以重新打通還原力循環(huán)，恢復(fù)還原力平衡（圖4）。

如在大腸桿菌中引入來源于克雷伯氏菌的ATP 依賴的二羥丙酮激酶DhaK， 取代大腸桿菌本身的PEP 依賴的二羥丙酮激酶DhaKLM，每催化一分子的甘油可以額外產(chǎn)生一分子的NADH，為菌體生長提供還原力和能量。 使用此策略，琥珀酸的產(chǎn)率達到 0.47 g/（g·h），為已知的最高產(chǎn)量[57]。 L-丙氨酸的傳統(tǒng)好氧生產(chǎn)中，需要5 步合成反應(yīng)，每生產(chǎn)1 t 的產(chǎn)品需要排放0.5 t 的二氧化碳， 產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率為67%，生產(chǎn)成本為1.8 萬元/t。 經(jīng)過重新設(shè)計大腸桿菌的代謝網(wǎng)絡(luò)，平衡胞內(nèi)還原力，獲得在厭氧型發(fā)酵下高效合成L-丙氨酸。該基因工程菌株可以實現(xiàn)一步發(fā)酵合成L-丙氨酸，發(fā)酵過程不產(chǎn)生二氧化碳排放，產(chǎn)品轉(zhuǎn)化率提升到90%，生產(chǎn)成本直接降至0.9 萬元/t[58]。 另外，通過在D-乳酸和丁二酸的傳統(tǒng)發(fā)酵菌株中重新建立一種新的能量代謝模式，用C5 磷酸戊糖替代C6 糖酵解， 實現(xiàn)了丁二酸合成途徑的還原力自平衡，提高了產(chǎn)量，降低能耗[59-60]。

圖4 細胞氧化還原力的平衡Fig.4 Redox balance in cell

3.3.2 發(fā)酵食品微生物群落的人工合成發(fā)酵食品的人工合成菌群系統(tǒng)具有相對簡單、 可重復(fù)、可培養(yǎng)等特點。 實現(xiàn)人工合成（組裝與調(diào)控），可解決風(fēng)味、安全與健康等問題。 首先需要對發(fā)酵食品中原來菌群組成進行鑒定。 通過宏基因組測序、擴增子測序及熒光定量PCR 等技術(shù)，確定原始菌群中微生物數(shù)量、種類及隨發(fā)酵進程的豐度變化。 在確定原生菌群組成后，進一步對菌群功能進行分析。 對發(fā)酵系統(tǒng)的發(fā)酵條件如pH、溫度、鹽分、水分等進行控制，或?qū)Πl(fā)酵體系中的菌群進行不同組合的接種，利用合成生物學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)對發(fā)酵體系進行檢測，確定各種微生物之間相互作用、微生物與環(huán)境之間的相互作用，確定不同微生物對發(fā)酵產(chǎn)品品質(zhì)的影響。 最后，對發(fā)酵體系中原有的微生物進行改造、替換或者刪減，獲得人工合成的微生物群落并用于發(fā)酵，獲得品質(zhì)提升的發(fā)酵產(chǎn)品（圖5）。

圖5 重構(gòu)微生物群落Fig.5 Reconstruction of synthetic microbiota

Wang 等通過對中國淡香型白酒發(fā)酵過程中的微生物群落進行分析，確定了乳酸菌、釀酒酵母菌、畢赤酵母、 假絲酵母及畢赤酵母等5 種為核心菌群。 構(gòu)建了基于核心菌群的人工菌群并進行發(fā)酵，實現(xiàn)了清香型白酒的穩(wěn)產(chǎn)和可重復(fù)操作[61]。 May 等仔細分析了康普茶中微生物種類及在發(fā)酵康普茶中各種微生物的作用。 發(fā)現(xiàn)酵母菌的主要作用為糖化底物和合成乙醇，細菌的主要作用為產(chǎn)生生物膜及合成有機酸。 其中生物膜起到物理隔離雜菌入侵的作用，而乙醇和有機酸則可以對入侵的雜菌起到抑制生長的作用[62]。

3.3.3 構(gòu)建自養(yǎng)型微生物發(fā)酵工廠微生物大體上可以分為以二氧化碳為碳源的自養(yǎng)型微生物和以有機物為碳源的異養(yǎng)型微生物。 以異養(yǎng)型微生物為菌株進行發(fā)酵，碳源占到發(fā)酵成本的30%～70%，如果菌體可以實現(xiàn)碳源自養(yǎng)， 將可以節(jié)省成本1/3以上。 盡管人們對微生物自養(yǎng)型生產(chǎn)產(chǎn)品興趣濃厚，但迄今為止，改造異養(yǎng)微生物實現(xiàn)固定二氧化碳，仍然是一個嚴峻的挑戰(zhàn)（圖6）。

Antonovsky 等通過代謝途徑的理性重排、 重組表達和定向進化，將完整的Calvin-Benson-Bassham循環(huán)的相關(guān)基因?qū)氲酱竽c桿菌中，實現(xiàn)了在大腸桿菌中利用二氧化碳為碳源合成糖類等生物物質(zhì)[63]。然而在該實驗中，外源固定的二氧化碳僅用于生物物質(zhì)的合成，不能為生物生長提供能量，需要額外添加丙酮酸，利用丙酮酸氧化產(chǎn)生能量為菌體生長供能，并未實現(xiàn)二氧化碳的凈固定。 Gleizer 等引入利用甲酸鹽提供能量和還原力的相關(guān)基因，同時共表達二磷酸核酮糖羧化酶和磷酸核酮糖激酶與甲酸脫氫酶， 再引入Calvin-Benson-Bassham 循環(huán)基因，構(gòu)建了以二氧化碳為唯一碳源的大腸桿菌工程菌[64]。 改造后的工程菌可以以無機碳源二氧化碳為碳源合成細胞結(jié)構(gòu)，并利用無機鹽或者光能作為能源來源，為細胞供能。 未來，改造并獲得自養(yǎng)型工程菌，使其可以直接利用大氣中的二氧化碳和氮氣為碳源和氮源， 利用光能作為能量來源合成食物、燃料等，可以顯著降低生產(chǎn)成本，并降低溫室氣體的排放。

圖6 構(gòu)建固定二氧化碳微生物工廠Fig.6 Engineering carbon fixation microbial factory

3.3.4 人工設(shè)計酶從自然界獲得的酶催化效率較低時，大部分只能在實驗室通過費時費力的適應(yīng)性進化來篩選催化效率提高的突變體。 蛋白酶的結(jié)構(gòu)決定了自身的功能，根據(jù)酶的結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系，理性設(shè)計和改造活性位點，設(shè)計高催化活性的酶，甚至創(chuàng)造具有新功能的酶，就可以大大降低篩選酶的工作量，提高成功率（圖7）。

圖7 人工設(shè)計酶Fig.7 Artificial redesign of enzymes

Li 等基于人工智能蛋白質(zhì)設(shè)計技術(shù)，綜合選用勢能計算、近似反應(yīng)態(tài)幾何尺度限定與蒙特卡洛隨機序列空間掃描等計算方法，構(gòu)建了具有絕對位置選擇性與立體選擇性的人工β-氨基酸合成酶。人工設(shè)計的酶轉(zhuǎn)化率高達99%[65]。 乙酰輔酶A 是重要的中心化合物， 是多種重要化合物合成的起點化合物， 但是在大腸桿菌中， 從葡萄糖合成乙酰輔酶A路徑長且耗能高。 Lu 等基于硫胺素焦磷酸TPP 介導(dǎo)的碳碳成鍵催化機理，首先設(shè)計了一個全新的羥基乙醛合酶， 然后基于磷酸轉(zhuǎn)酮酶的催化原理，設(shè)計了一個全新的乙酰磷酸合酶。 將兩個人工合成的酶同時導(dǎo)入到菌體中，創(chuàng)建出僅三步合成乙酰輔酶A 的非天然全新途徑，可以以甲醇、甲醛或乙醇醛為碳源維持細胞生長[66]?；谌斯ぴO(shè)計，獲得自然界不存在的酶，建立特殊的反應(yīng)，是未來發(fā)酵工程的重要發(fā)展方向。

4 展 望

現(xiàn)代生物技術(shù)具有可預(yù)測、可再造、可調(diào)控等特點，在人造生命、器官再造、生物存儲、高能細胞、人機交互等方面發(fā)展迅速。 新一代發(fā)酵工程技術(shù)的關(guān)鍵是智能、節(jié)約和高效。 中國發(fā)酵工業(yè)技術(shù)與國際最先進水平的關(guān)系大多數(shù)還是跟跑和伴跑，開展新一代發(fā)酵技術(shù)是實現(xiàn)領(lǐng)跑的契機。 通過與其他學(xué)科的交叉融合，發(fā)酵工程技術(shù)的主要研究應(yīng)該從產(chǎn)品制造和技術(shù)改進，拓展到新理論的發(fā)現(xiàn)、新方法的發(fā)明、新學(xué)科的發(fā)生、新產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，對中國傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級、新經(jīng)濟形態(tài)構(gòu)建、經(jīng)濟和國防安全保障做出重要貢獻。