楊亞琴 馮慧慧 劉進璽 馬 瑩 董小海 曹 秀 鐘紅艦

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室(鄭州)，河南鄭州450002）

伏馬毒素（Fumonisin）是20 世紀80 年代末發(fā)現(xiàn)的一類主要由串珠鐮刀菌、多育鐮刀菌和輪狀鐮刀菌在一定溫度和濕度條件下產(chǎn)生的水溶性次級代謝物，是由不同多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物[1-2]。已發(fā)現(xiàn)的28種伏馬毒素類似物中，B族伏馬毒素是野生型菌株產(chǎn)量最豐富的，主要以伏馬毒素B1（FB1）、伏馬毒素B2（FB2）、伏馬毒素B3（FB3）形式存在。研究表明，伏馬毒素具有很強的神經(jīng)毒性、肺毒性、免疫毒性和致癌性等[3～5]，世界衛(wèi)生組織（WHO）癌癥研究機構(gòu)（IARC）于1993 年就已將其劃為2B 類致癌物。伏馬毒素普遍存在于玉米、小麥、水稻等谷類作物中，而谷類作物及其制品作為飼料的重要來源，致使伏馬毒素成為污染飼料的主要真菌毒素之一，對動物和人類健康均產(chǎn)生潛在危害[6-8]。目前，我國對飼料原料玉米及其加工產(chǎn)品中FB1 和FB2 總量的限量值為60 mg/kg；飼料產(chǎn)品豬、兔、馬配合飼料中FB1 和FB2總量的限量值為5 mg/kg，家禽配合飼料限量值為20 mg/kg，魚配合飼料限量值為10 mg/kg；而小麥及其制品中伏馬毒素的限量則未做明確規(guī)定[9]。

伏馬毒素的常用分析方法有酶聯(lián)免疫法[10]、氣相色譜法[11]、液相色譜法[12～14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]等。其中，酶聯(lián)免疫法操作簡單、快速，但其準(zhǔn)確度較低；氣相色譜法一般需要前處理過程中對目標(biāo)化合物進行衍生化反應(yīng)，方法穩(wěn)定性較差；液相色譜法通常采用柱前或柱后衍生的方法進行測定，樣品提取液多采用免疫親和柱進行凈化，分析成本偏高；而液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因其選擇性好、抗干擾能力強、靈敏度高等特點，已成為近年來谷類作物中真菌毒素測定的主要研究方法[17-19]。本研究選取飼料用玉米和小麥麩皮為對象，針對樣品基質(zhì)的特點，采用分散固相萃取凈化管和PRIME HLB固相萃取柱有效去除玉米和小麥麩皮樣品中碳水化合物、蛋白質(zhì)、磷脂、植物纖維等干擾物，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀準(zhǔn)確進行FB1、FB2和FB3的定性定量分析。該方法操作便捷，凈化效果好，回收率和靈敏度高，適用于玉米和小麥麩皮樣品中伏馬毒素的批量檢測分析，易于在農(nóng)產(chǎn)品和飼料分析檢測領(lǐng)域推廣應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Shimadzu LCMS-8050 型液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（日本島津公司）；PGC 4502i電子天平[精確至0.01 g，英國艾德姆衡器（武漢）有限公司]；HY-6型雙層搖瓶機（金壇市醫(yī)療儀器廠）；飛鴿GL-21B型高速冷凍離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；QGC-36T氮氣吹干儀（上海泉島公司）；SKQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（金壇市白塔新寶儀器廠）；Milli-Q超純水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/mL）（青島普瑞邦生物工程有限公司）；甲醇、乙腈：色譜純（德國默克股份兩合公司）；甲酸：分析純（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；分散固相萃取凈化管（含500 mg五水硫酸鎂、250 mg 氯化鈉、250 mg 檸檬酸三鈉和250 mg C18）（吳橋津楊過濾器材廠）；PRIME HLB 固相萃取柱（60 mg/3 mL）（美國Waters公司）；實驗室用水為Milli-Q超純水；玉米與小麥麩皮樣品，市售。

1.2 樣品前處理

稱取5 g粉碎后的樣品，放入50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL水浸泡1 h，加入15 mL 2%甲酸乙腈溶液，充分混勻1 min，室溫下超聲提取10 min、振蕩提取30 min，然后于5 000 r/min離心5 min。

取5 mL提取液至分散固相萃取凈化管，渦旋2 min，于5 000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確吸取上層清液2 mL，40 ℃氮吹至干，用1 mL甲醇超聲復(fù)溶，過經(jīng)0.5 mL甲醇潤濕后的PRIME HLB固相萃取柱凈化，收集流出液，相同體積加水混勻后，過0.22 μm微孔濾膜待上機測定。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱，Waters CORTECS UPLC C18柱（50 mm×2.1 mm, 1.6 μm）；柱溫：40 ℃；進樣體積：1 μL；流動相A：甲醇；流動相B：含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序：0～1 min，10% A；1～2 min，10%～38% A；2～5 min，38%～45% A；5～10 min，45%～90% A；10～11 min，90% A；11～11.5 min，90%～10%A；11.5～16 min，10% A；流速為0.3 mL/min。

電噴霧離子源，正離子模式（ESI+）；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子化電壓：4 kV；霧化氣流速3 L/min；干燥氣流速10 L/min；加熱氣流速10 L/min；脫溶劑管溫度250 ℃；接口溫度300 ℃；加熱模塊溫度400 ℃；碰撞誘導(dǎo)電離氣體壓力270 kPa；質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化（見表1）

試驗采用電噴霧離子源正離子模式（ESI+）掃描分析3種伏馬毒素化合物。通過對質(zhì)量濃度為500 ng/mL的3種化合物標(biāo)準(zhǔn)溶液分別進行全掃描得到[M+H]+前體離子，再對前體離子進行二級質(zhì)譜掃描，通過優(yōu)化條件得到產(chǎn)物離子及相應(yīng)的電壓、碰撞能量等參數(shù)，使每種化合物的前體離子與特征產(chǎn)物離子產(chǎn)生的離子對強度達到最大，選擇其中相對豐度最強的產(chǎn)物離子作為定量離子，優(yōu)化后的參數(shù)見表1。

2.2 色譜條件優(yōu)化（見圖1）

采用質(zhì)量濃度為50 ng/mL的溶劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，保持其他儀器條件不變，比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、甲醇-含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液3種流動相體系在相同液相分離程序下，目標(biāo)化合物的出峰情況。通過對比，使用甲醇-含5 mmol/L乙酸銨的0.1%甲酸水溶液流動相體系產(chǎn)生的峰形要優(yōu)于使用甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液流動相體系產(chǎn)生的峰形。伏馬毒素在電噴霧離子源正離子模式（ESI+）下產(chǎn)生的是[M+H]+離子，在甲醇和水體系中添加容易揮發(fā)的甲酸有助于伏馬毒素的離子化，適量乙酸銨的加入能有效地改善伏馬毒素的峰形。因此，試驗最終采用甲醇-含5 mmol/L 乙酸銨的0.1%甲酸水溶液作為流動相，在1.3 試驗梯度洗脫程序條件下，3 種伏馬毒素化合物的分離效果良好，色譜圖峰形對稱且靈敏度高，如圖1所示。

表1 FB1、FB2、FB3的質(zhì)譜參數(shù)

圖1 FB1、FB2、FB3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 ng/mL）色譜

2.3 提取溶劑的選擇（見圖2）

乙腈-水混合提取液在過量氯化鈉等無機鹽存在時，根據(jù)鹽析效應(yīng)乙腈和水發(fā)生兩相分離，水溶性雜質(zhì)溶于水相、目標(biāo)化合物溶于乙腈相，以達到初步分離凈化的目的。本試驗在相同空白基質(zhì)樣品中添加3 種伏馬毒素（添加濃度為100 μg/kg），考察了經(jīng)水浸泡后，相同體積乙腈、0.5%甲酸乙腈、2%甲酸乙腈3種提取溶劑對玉米和小麥麩皮樣品中的伏馬毒素目標(biāo)化合物的提取效果。按照1.2 前處理步驟，樣品提取液經(jīng)分散固相萃取凈化管凈化后，吸取上層乙腈相吹干，甲醇復(fù)溶直接過PRIME HLB固相萃取柱，去除玉米和小麥麩皮樣品中的蛋白質(zhì)、磷脂等干擾物，相同體積加水混勻后上機。測定結(jié)果表明，隨著水-乙腈溶液中甲酸含量的增加，玉米和小麥麩皮樣品中伏馬毒素的回收率均呈現(xiàn)上升趨勢，如圖2。因此，本試驗最終選擇水-2%甲酸乙腈（50∶50，V/V）作為樣品中伏馬毒素測定的提取溶劑。

圖2 不同提取溶劑對玉米（上）和小麥麩皮（下）中3種伏馬毒素（添加濃度100 μg/kg）回收率的影響

2.4 線性范圍、檢出限及定量限（見圖3、表2）

取適量的伏馬毒素（FB1、FB2、FB3）標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別用空白玉米和小麥麩皮樣品基質(zhì)溶液配制成質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10、25、50、100、250 ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng/mL），目標(biāo)物定量離子對的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）繪制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖3）。結(jié)果表明，玉米基質(zhì)溶液中，3 種伏馬毒素目標(biāo)物在1.0～250 ng/mL 濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性，F(xiàn)B1、FB2、FB3 的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 2、0.999 3、0.999 2；小麥麩皮基質(zhì)溶液中，3種伏馬毒素目標(biāo)物在1.0～250 ng/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系亦表現(xiàn)良好，F(xiàn)B1、FB2、FB3 的相關(guān)系數(shù)（R2）分別為0.999 6、0.999 1、0.999 3（見表2）。由于不同基質(zhì)溶液中，3 種伏馬毒素在相同濃度下的信號響應(yīng)差異明顯，在進行實際樣品含量測定時，要選擇相同基質(zhì)的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線準(zhǔn)確定量評價。當(dāng)陽性樣品中目標(biāo)物的上機濃度大于此線性范圍上限時，應(yīng)采取減小稱樣量或?qū)δ繕?biāo)分析物進行稀釋處理后重新進行測定。

圖3 3種伏馬毒素的玉米和小麥麩皮基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用向空白玉米和小麥麩皮樣品中逐級降低加入標(biāo)液濃度的方法來確定檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。以3 倍信噪比（S/N=3）對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）對應(yīng)的目標(biāo)物濃度作為定量限，3種伏馬毒素在玉米和小麥麩皮樣品中的方法檢出限均為1.0 μg/kg，方法定量限均為3.0 μg/kg，滿足飼料中伏馬毒素的分析要求[20]。

2.5 方法回收率與精密度（見表3）

在確定的試驗條件下，分別向空白玉米和小麥麩皮樣品中添加FB1、FB2、FB3混合標(biāo)準(zhǔn)溶液至3.0、20、100 μg/kg 3個濃度水平，每個添加濃度水平重復(fù)3次，進行方法回收率與精密度測定（表3）。3種伏馬毒素在玉米基質(zhì)中3 個添加濃度水平的回收率范圍在83.65%～107.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 范圍在2.03%～7.00%；在小麥麩皮基質(zhì)中3 個添加濃度水平的回收率范圍在88.79%～103.5%，RSD范圍在1.41%～8.98%，表明方法準(zhǔn)確可靠，重復(fù)性良好。

2.6 實際樣品檢測

應(yīng)用本研究所建立的測定方法對當(dāng)?shù)厥袌錾腺徺I的15個玉米、15個小麥麩皮樣品中FB1、FB2和FB3進行了檢測。結(jié)果顯示，玉米樣品中3種伏馬毒素均全部檢出，以總量計，其含量水平范圍在266～5 830 μg/kg。小麥麩皮樣品中FB1 檢出7 個、FB2 檢出4 個、FB3 檢出5 個，伏馬毒素總檢出率為46.67%，檢出樣品中伏馬毒素總量的污染水平范圍在13.9～170 μg/kg。參考我國飼料產(chǎn)品中FB1 和FB2 總量的限量值范圍（5～60 mg/kg）[9]，除1 個玉米樣品伏馬毒素總量5.83 mg/kg超出飼料產(chǎn)品最低限量值外，其余29 個檢測樣品均滿足飼料標(biāo)準(zhǔn)的限量要求。

3 討論

本研究在參考文獻的基礎(chǔ)上，通過對儀器條件、提取溶劑的選擇與優(yōu)化，確定了飼料用玉米和小麥麩皮中伏馬毒素的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。樣品經(jīng)水-2%甲酸乙腈（50∶50，V/V）提取，分散固相萃取凈化管鹽析效應(yīng)下去除提取液中的水溶性雜質(zhì)，上層乙腈提取液用甲醇進行溶劑轉(zhuǎn)換后，過PRIME HLB固相萃取柱以除去蛋白質(zhì)、磷脂等干擾物，流出液同體積加水混勻后采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線外標(biāo)法定量。相較于國家標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法[15，20]，該方法減少了操作步驟和有機溶劑的使用，重現(xiàn)性好、靈敏度高，完全符合我國對飼料中伏馬毒素含量的檢測要求，且方法檢測效率高，適合批量樣品的處理與分析。

4 結(jié)論

本研究采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀建立了飼料用玉米和小麥麩皮中3種伏馬毒素的測定方法。結(jié)果顯示，該方法中伏馬毒素（FB1、FB2 和FB3）的檢出限均為1.0 μg/kg，定量限均為3.0 μg/kg，在3.0、20、100 μg/kg 3個添加濃度水平下，玉米和小麥麩皮樣品平均回收率在83.65%～107.3%之間，RSD在1.41%～8.98%之間，能夠滿足飼料用玉米和小麥麩皮中伏馬毒素的檢測要求，亦可為其他飼料基質(zhì)中伏馬毒素含量的測定提供參考。

表2 玉米和小麥麩皮基質(zhì)溶液中3種伏馬毒素的線性方程、濃度范圍及相關(guān)系數(shù)

表3 玉米和小麥麩皮中3種伏馬毒素的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=3）