方敦煌，童治軍，焦芳嬋，吳興富，張光海，肖炳光，張誼寒，李永平，陳學軍

云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院 煙草行業(yè)煙草生物技術育種重點實驗室國家煙草基因工程研究中心，昆明市五華區(qū)圓通街33 號 650021

黑脛病是我國煙葉生產(chǎn)中的主要土傳病害之一，主要危害煙草根及莖基部，每年造成較大的經(jīng)濟損失。普通煙草花葉病（TMV）也是云南等煙葉主產(chǎn)區(qū)分布廣、危害重的病害［1-2］。因此，選育推廣抗黑脛病及TMV 的品種，是應對這兩種病害的最為經(jīng)濟和有效的防控手段。有性雜交、系統(tǒng)選育、雜種優(yōu)勢利用是傳統(tǒng)育種的3 種重要方法，目前我國主栽烤煙品種主要通過有性雜交育種、系統(tǒng)選育和雜種優(yōu)勢利用并重選育而成。但傳統(tǒng)育種存在周期長、篩選效率低等問題，而且育成的新品種單一、遺傳基礎狹窄、品質(zhì)與抗性不能兼顧。為創(chuàng)新種質(zhì)資源、培育多抗品種、縮短育種周期，開發(fā)了單倍體育種技術，如利用單倍體通過2 個世代即可獲得純合雙單倍體（DH）系。利用花藥培養(yǎng)、遠緣雜交及栽培種間雜交，因孤雌生殖獲得單倍體是包括煙草在內(nèi)的多種作物最常用的途徑［3］，遠緣雜交及栽培種間雜交獲得的母本來源單倍體（MDH）除了能快速育成來自母本遺傳性狀的穩(wěn)定純系，還具有農(nóng)藝性狀及產(chǎn)質(zhì)量穩(wěn)定的優(yōu)點?；ㄋ幖颖杜囵B(yǎng)獲得的雙單倍體（DH）存在農(nóng)藝性狀較差、產(chǎn)量低的缺陷［4］，栽培種之間雜交因孤雌生殖也可誘導MDH 單倍體，但頻率極低，已被Lewis 等［5］轉(zhuǎn)擬南芥花青素轉(zhuǎn)錄因子PAP1 基因的品種所證實。遠緣雜交誘導單倍體技術是一種以普通煙草（Nicotiana tabacum）為母本、野生種非洲煙草（Nicotiana africana）為父本的雜交后代孤雌生殖所產(chǎn)生的單倍體［4］，因而在常規(guī)育種基礎上，母本起源單倍體育種等新技術也在育種實踐中得到廣泛使用，其在縮短育種周期、提高目標性狀篩選效率等方面發(fā)揮了重要作用。20 世紀90 年代以來美國先后培育出NC2000、NC71 和NC196 等煙草品種［6-9］。本項目組在前期適宜的授粉時期和套袋方式對單倍體誘導頻率研究的基礎上［10］，獲得了雙抗TMV 和PVY 的煙草株系［11］。為此，采用野生種非洲煙草并通過雜交技術，以煙草黑脛?。≒hytophthora nicotianae）（0 號生理小種）抗源Coker 371［12］與普通花葉?。═obacco Mosaic Virus，TMV）抗源Coker176［13］為材料進行了雙抗黑脛病及TMV 的種質(zhì)資源創(chuàng)制，旨在為優(yōu)良、特色品種的抗病性定向改良提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通煙草（N. tabacum）紅花大金元（紅大）、Coker371 和Coker176，煙屬野生種非洲煙草（N.africana），均由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供。

1.2 方法

1.2.1 母本來源雜交

以Coker371 為母本、Coker176 為父本進行常規(guī)雜交，獲得Coker371×Coker176 雜交F1種（簡稱CC）。再以CC 為母本、野生種非洲煙草為父本，參照曾建敏等［9］優(yōu)化的方式授粉、紙管套袋，收獲成熟的煙草雜交種子。

1.2.2 母本來源單倍體鑒別

按Wernsman 等［3］描述的方法進行單倍體苗期形態(tài)鑒別；用流式細胞儀測定其形態(tài)鑒別為單倍體植株的染色體倍型。

1.2.3 母本來源單倍體植株的分子標記輔助選擇及組織培養(yǎng)加倍

分子標記輔助選擇時，抗黑脛病的PhP基因分子標記檢測、抗TMV 的N基因分子標記檢測分別參照Lewis 等［13］和Johnson 等［12］的方法進行。

組織培養(yǎng)加倍按Kasperbauer 等［14］和劉勇等［11］改進的方法進行。選擇的母本來源單倍體植株進入現(xiàn)蕾期（圖1b）后，取中部葉片中脈，在超凈工作臺先用75 %乙醇消毒1 min，無菌水沖洗2 次，將切好的葉脈接種到MS+KT 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 的誘芽培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d 后且葉片長出叢生芽2 cm 高時，切取芽接種到1/2MS 培養(yǎng)基+IBA 0.5 mg/L 中進行誘根生長培養(yǎng)。

1.2.4 雙抗種質(zhì)的鑒別

采用菌絲塊創(chuàng)傷貼接法進行黑脛病抗性鑒定。每個株系處理24 株，重復3 次，以病情指數(shù)評 價 抗 感 性［15］；采 用 國 家 標 準GB/T 23222—2008［16］進行TMV 抗性鑒定，病毒汁液摩擦接種，3次重復，每重復16 株。按1.2.3 中母本來源單倍體植株的分子標記輔助選擇方法進行分子標記輔助檢測。

在云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院試驗基地進行農(nóng)藝性狀試驗。試驗地塊為紅壤土，土壤肥力中等。采用隨機區(qū)組設計，3 次重復，每小區(qū)面積40 m2，株行距0.50 m ×1.20 m，施純氮90 kg/hm2［m（N）∶m（P）∶m（K）=1∶1.5∶2］。移栽32 d 后，每周分別測定紅大、Coker371、Coker176 和篩選獲得的雙抗TMV 及黑脛病種質(zhì)的株高與葉片數(shù)，連續(xù)測定6周；煙株打頂后調(diào)查株高、腰葉長寬、節(jié)距和莖圍等農(nóng)藝性狀指標［17］。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用DPS 10.5 統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。Duncan’s 新復極差法進行數(shù)據(jù)間差異的顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 母本來源單倍體的鑒別

母本來源獲得的雜交種播種25 d 后，發(fā)現(xiàn)遠緣雜交后代大部分苗出現(xiàn)致死性狀，這與前人的研究結果一致［15］。存活的煙苗中，多數(shù)為混倍體，兩片真葉表現(xiàn)凹痕的煙苗為單倍體苗（圖1a），至現(xiàn)蕾期仍有部分葉片表現(xiàn)為凹痕（圖1b）。流式細胞術倍性分析表明，母本來源的單倍體峰值位于24 500（圖1 c），而對照紅大的峰值位于49 800（圖1 d）。

2.2 分子標記輔助篩選及組織培養(yǎng)加倍

對獲得的5 株母本來源單倍體材料進行抗黑脛病PhP基因和抗TMVN基因分子標記分析，結果見圖2。從圖2 中可見，擴增出約770 bp 的PhP基因特異片斷的單倍體植株為H1、H4 和H5，擴增出約540 bpN基因特異片斷的植株為H1、H2、H3和H4，選擇能同時擴增PhP基因片段和N基因片段的H1 和H4 作為雙抗母本來源的單倍體植株。

目標單倍體植株現(xiàn)蕾后，H1 和H4 的總?cè)~片數(shù)相同，均為13 片，而H1 的腰葉（長×寬為35 cm×25 cm）大于H4（37 cm×20 cm），故選擇H1 單倍體植株進行組織培養(yǎng)加倍。取H1 植株中部葉片葉脈（圖3a），消毒并切除葉脈邊緣葉肉后接種到加倍培養(yǎng)基上（圖3b），35 d 左右葉脈長出叢生芽（圖3c），叢生芽生根移栽后，獲得正常開花結實的加倍母本來源單倍體（圖3d），命名為RBST［雙抗黑脛病及TMV 烤煙新種質(zhì)（Resistant to black shank and TMV）］，單株形態(tài)見圖4。

2.3 雙抗RBST 種質(zhì)的鑒別

黑脛病苗期抗性鑒定結果（表1）表明，加倍母本來源單倍體RBST 和Coker371 的病情指數(shù)均為0，Coker176 和紅大的病情指數(shù)分別為87 和92。TMV 抗病性鑒定結果（表1）表明，RBST 與Coker 176 表現(xiàn)出枯斑，而Coker371 和紅大無枯斑反應，系統(tǒng)侵染表現(xiàn)為花葉。抗黑脛病的PhP基因分子標記檢測和抗TMV 的N基因分子標記檢測結果（圖5）表明，RBST 材料可擴增出抗黑脛病的PhP基因和抗TMV 的N基因特異片段，與常規(guī)抗性鑒定結果相吻合。

表1 雙單倍體的抗性鑒定Tab.1 Resistance identification of double haploid

農(nóng)藝性狀指標調(diào)查結果（圖6）表明，供試材料均在移栽后39 d 生長速率明顯加快。在移栽后53 d 3 份抗病材料煙株株高依然增長，而常規(guī)紅大品種株高增長則趨緩；Coker176 品種葉片數(shù)增加趨緩，而其他材料葉片數(shù)仍在較快增加。

株高、葉長、葉寬、節(jié)距及莖圍等農(nóng)藝性狀指標測定結果（圖7）表明，RBST 材料除株高與其他材料無顯著差異外，腰葉長與寬、節(jié)距及莖圍均顯著低于主栽品種紅大，腰葉長顯著低于雙親，但節(jié)距、莖圍與雙親差異不顯著。

3 討論

在前期研究基礎上［10-11］利用母本來源單倍體育種技術，采用流式細胞術（Flow cytometry，F(xiàn)CM）進行苗期單倍體輔助篩選，并創(chuàng)制了雙抗黑脛病和TMV 的種質(zhì)RBST，可用于煙草品種的抗病改良和PhP基因的定位克?。?8］。母本來源單倍體育種技術也可快速聚合2 種及以上的其他性狀，獲得性狀穩(wěn)定的新品種。再次驗證了母本來源單倍體育種技術在煙草育種中具有基因型多樣化、周期短、選擇效率高、易操作等優(yōu)點，能快速穩(wěn)定抗病等優(yōu)良性狀、提高育種篩選效率、加快煙草育種進程，只需兩代即可獲高純度、不受遺傳背景限制的雙單倍體系。同時，在遺傳學研究上可應用于遺傳圖譜的構建、基因定位及克隆。

在利用母本來源單倍體育種技術實踐中，提高單倍體誘導率、篩選效率和加倍率是三大關鍵技術環(huán)節(jié)，決定著整個育種工作流程的效率和工效。Lewis 等［5］及Hancock 等［19］學者采用轉(zhuǎn)基因手段，實現(xiàn)了苗期單倍體植株的高效篩選，但因存在轉(zhuǎn)基因材料擴散的風險而難以推廣使用。因此，在探究不同生態(tài)環(huán)境、不同母本基因型以及不同生態(tài)型與母本基因型互作對單倍體誘導率影響的基礎上，采用非轉(zhuǎn)基因手段，拓寬類似非洲煙草單倍體誘導系，研究適宜的與單倍體密切相關的標記，不斷提高雜交誘導產(chǎn)生單倍體的誘導率方面還有待進一步深入試驗。同時，雜交誘導孤雌生殖的機理及其遺傳規(guī)律、加倍機制也是母本來源單倍體育種技術的重要課題，有待進一步研究。

4 結論

通過優(yōu)化的紙管法增加單倍體誘導率、苗期形態(tài)和流式細胞術配合快速高效篩選單倍體、分子標記輔助選擇和人工接種相結合進行抗病鑒定，利用母本來源單倍體育種技術將攜帶黑脛病抗性PhP基因的Coker 371 與TMV 抗性N基因的Coker 176 雜交F1與煙屬野生種非洲煙草雜交，創(chuàng)制了雙抗黑脛病及TMV 的種質(zhì)RBST。苗期人工接種抗病鑒定、分子標記輔助檢測和田間農(nóng)藝性狀鑒定表明，RBST 的抗病性和農(nóng)藝性狀穩(wěn)定，可用作煙草品種抗性定向改良的抗源材料。