臧 云，紀(jì)桂霞，楊 鵬，徐蓬軍，王秀芳，鄧 寧，譚菲菲，王新偉，任廣偉*

1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東省青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11 號(hào) 266101

2 .四川省煙草公司攀枝花市公司，四川省攀枝花市東區(qū)龍珠路31 號(hào) 617026

煙草甲［Lasioderma serricorne（Fabricius）］是一種世界性的倉(cāng)儲(chǔ)害蟲，屬鞘翅目（Coleoptera）、竊蠢科（Anobiidae）［1-2］。煙草甲食性復(fù)雜，既能取食一些倉(cāng)儲(chǔ)糧食和中草藥，又能取食倉(cāng)庫(kù)中儲(chǔ)藏的煙葉以及卷煙和雪茄等煙草制品。被蛀食后的煙葉因殘缺不全、蟲糞蟲尸污染等嚴(yán)重影響煙葉的可用性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界每年因煙草甲等倉(cāng)儲(chǔ)害蟲為害造成的煙葉蟲蛀損失占煙葉總儲(chǔ)存量的1%［3］；我國(guó)煙葉每年因倉(cāng)儲(chǔ)害蟲為害造成的煙葉蟲蛀損失大約為1.64%［4］。目前國(guó)內(nèi)主要采取磷化氫熏蒸防治煙草甲，但磷化氫熏蒸若操作不當(dāng)，會(huì)對(duì)作業(yè)人員、貨物和環(huán)境造成安全隱患［5］，我國(guó)已于2020 年限制其使用［6］。因此，急需研究與環(huán)境相容性好，且使用安全的煙草甲防治措施，以減少熏蒸次數(shù)，有效控制倉(cāng)儲(chǔ)害蟲。近年來，利用昆蟲的趨光性進(jìn)行誘殺已逐漸成為防治害蟲的重要方式之一。與其他防治方法相比，燈光誘捕防治有利于延緩害蟲抗藥性、降低防治成本、減少環(huán)境污染，符合生態(tài)治理的發(fā)展方向［7-8］。已有研究證實(shí)，煙草甲具有一定的趨光性，Kirkpatrick 等［9］、Soderstrom 等［10］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多數(shù)煙草甲成蟲會(huì)被紫光吸引；Tsuji［11］研究表明兩個(gè)紫光燈管的誘蟲燈對(duì)煙草甲的誘捕數(shù)量顯著高于1 個(gè)紫光燈管的誘蟲燈；Katsuki 等［12］試驗(yàn)比較了7 種LED 燈對(duì)煙草甲的誘集率，其中紫光和藍(lán)光LED 燈比其他光源LED 燈吸引的煙草甲更多；Hironaka 等［13］發(fā)現(xiàn)在光強(qiáng)相同時(shí)，紫光LED 燈比藍(lán)光LED 燈更能吸引煙草甲?？梢?，以往的研究多關(guān)注不同顏色燈光對(duì)煙草甲的吸引作用，但對(duì)光波長(zhǎng)的系統(tǒng)研究報(bào)道較少。

昆蟲對(duì)光的感知依賴于由視蛋白和發(fā)色團(tuán)組成的視紫紅質(zhì)［14］，其中視蛋白是一種具有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和一個(gè)賴氨酸殘基的G 蛋白偶聯(lián)受體［15］，其氨基酸序列的不同影響昆蟲對(duì)敏感光的吸收［16］。由于基因復(fù)制和缺失導(dǎo)致的適應(yīng)性進(jìn)化不同，昆蟲視蛋白從類型到拷貝數(shù)均有所不同［17］。多數(shù)昆蟲具有3 種視蛋白，包括紫外敏感視蛋白（UV）、藍(lán)光敏感視蛋白（BL）和長(zhǎng)波敏感視蛋白（LW），分別形成對(duì)紫色光（325 ～430 nm）、藍(lán)色光（430 ～500 nm）和綠色光（＞500 nm）波長(zhǎng)最敏感的光色素［18-19］。在鞘翅目昆蟲中有一些缺失BL 視蛋白［20-21］，紅蜻蜓（Sympetrum frequens）擁有 多 個(gè) 視 蛋 白 基 因［22］，黑 腹 果 蠅（Drosophila melanogaster）則進(jìn)化出1 個(gè)新的亞家族，命名為藍(lán)綠敏感蛋白［18-19］，但煙草甲視蛋白基因序列和相關(guān)特征目前尚不明確。為此，在前人研究基礎(chǔ)上，以7 種波長(zhǎng)LED 燈為測(cè)試對(duì)象進(jìn)行了煙草甲趨光性試驗(yàn)，并克隆獲得了煙草甲視蛋白基因，旨在為將燈光誘捕技術(shù)應(yīng)用于煙草倉(cāng)儲(chǔ)害蟲的綜合治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試蟲源煙草甲采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙葉樣品儲(chǔ)藏室，用全麥酵母粉飼料在人工培養(yǎng)箱內(nèi)繼代大量繁殖后，取生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期一致的成蟲備用。飼養(yǎng)條件為：溫度（28±1）℃、相對(duì)濕度75%±5%。

趨光行為測(cè)試裝置由行為反應(yīng)箱和光源箱組成，參考Reisenman等［23］的方法并進(jìn)行改進(jìn)，見圖1。行為反應(yīng)箱長(zhǎng)600 mm、寬310 mm，分為光區(qū)和暗區(qū)兩部分，光區(qū)高500 mm、暗區(qū)高200 mm；頂部安裝光源，光源箱與光區(qū)均密閉不透光。試驗(yàn)時(shí)在光區(qū)放入白色粘蟲板。

供試光源為不同波長(zhǎng)LED 燈，由河南新鄉(xiāng)市天意新能源科技開發(fā)有限公司提供，波長(zhǎng)分別為360 ～365、400 ～405、450 ～460、515 ～525、600 ～605、620 ～625 和640 ～665 nm，使用Hioki 3423 照度計(jì)在50 cm 處測(cè)得上述波長(zhǎng)LED 燈光照度分別為5.2、4.6、49.4、242.0、25.4、55.0 和26.8 Lx，供試LED 燈電壓均為12 V。

實(shí)倉(cāng)誘捕試驗(yàn)所用風(fēng)吸式殺蟲燈由浙江安吉安寧生物科技有限公司提供。根據(jù)上述波長(zhǎng)篩選后選用包含最佳誘蟲波長(zhǎng)的常用市售殺蟲燈（AN-D-1008）進(jìn)行實(shí)倉(cāng)誘蟲試驗(yàn)，燈光峰值波長(zhǎng)400 nm 左右，距離燈管0.5、1.0 和1.5 m 處光照度分別為21.5、19.8 和17.7 Lx；設(shè)置黑光燈管作為對(duì)照，峰值波長(zhǎng)380 nm，0.5、1.0 和1.5 m 處光照度分別為32.0、28.5 和26.9 Lx。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同波長(zhǎng)燈光誘集試驗(yàn)

2019 年7 ～8 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行不同波長(zhǎng)燈光誘集試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)室溫度（26 ± 2）℃，相對(duì)濕度70%～80%。挑選2 日齡煙草甲成蟲進(jìn)行測(cè)試，煙草甲成蟲預(yù)先置于黑暗環(huán)境中處理1 h，再放入行為反應(yīng)箱的暗區(qū)，待處理15、30 和60 min 后，分別記錄在暗區(qū)的試蟲數(shù)，并計(jì)算趨光率。每波長(zhǎng)燈光分別處理20 頭，重復(fù)5 次。

1.2.2 實(shí)倉(cāng)誘捕試驗(yàn)

2019 年8～9 月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所煙葉倉(cāng)庫(kù)內(nèi)進(jìn)行誘蟲試驗(yàn)。倉(cāng)庫(kù)溫度（26 ±2）℃，相對(duì)濕度70% ～80%，倉(cāng)庫(kù)面積40 m2，倉(cāng)庫(kù)內(nèi)存放2016 ～2018 年云南、福建、山東等煙區(qū)生產(chǎn)的C3F、B2F 和X2F 等級(jí)初烤煙葉約500 kg，倉(cāng)庫(kù)內(nèi)有大量煙草甲成蟲。懸掛380 nm 和400 nm兩種波長(zhǎng)的殺蟲燈各1 臺(tái)，放置高度為1.5 m，兩燈相距5 m，試驗(yàn)中期兩臺(tái)殺蟲燈互換位置，以消除殺蟲燈位置差異產(chǎn)生的影響。每天18∶00 開燈，次日8∶00 關(guān)燈，每天8∶30 調(diào)查各處理誘集的煙草甲成蟲數(shù)量，連續(xù)調(diào)查16 d。

1.2.3 煙草甲轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

采集煙草甲幼蟲、蛹和雌雄成蟲各50 頭，混合后利用Tirzol 法提取RNA，具體步驟按照日本TaKaRa 公司動(dòng)物組織RNA 提取方法說明書進(jìn)行。由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯編和注釋。

1.2.4 基因克隆

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序序列信息，獲得煙草甲視蛋白基因序列。用日本TaKaRa Prime ScriptTMⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit 試 劑 盒 進(jìn) 行cDNA 反 轉(zhuǎn)錄。利用Primer5.0 軟件設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增LW基因的上游引物為L(zhǎng)Slw-F：5′-TGACCACCA CCATATCCG-3′，擴(kuò)增LW基因的下游引物為L(zhǎng)Slw-R：5′-ATTTTCCGTGTCCGTTTT-3′，擴(kuò)增UV 基因的上游引物為L(zhǎng)Suv-F：5′-ATGAACCTATACCTGAACT G-3′，擴(kuò)增UV基因的下游引物為L(zhǎng)Suv-R：5′- TTAAG AAGCAGCAGCAG-3′，引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成。使用日本TaKaRa 公司的TaqTM進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條 件：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 完成后，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的EasyPure Quick Gel Extraction Kit 試劑盒進(jìn)行膠回收。膠回收產(chǎn)物連接到T3 載體上，室溫連接30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至Trans1-T1 感受態(tài)細(xì)胞，加入無添加抗生素的LB 液體培養(yǎng)基于37 ℃、2 000 r/min 條件下振蕩培養(yǎng)，取菌液涂布在LB 固體培養(yǎng)基上，在37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。待菌落長(zhǎng)出后隨機(jī)挑選單菌落，用通用引物M13F 和M13R 進(jìn)行菌液PCR 檢測(cè)，選取陽性克隆菌株由上海派森諾生物科技股份有限公司測(cè)序。

1.2.5 序列生物信息學(xué)分析

將序列在NCBI 中用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具進(jìn)行同源性分析，利用在線軟件ORF Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.Html）查找序列的開放閱讀框，運(yùn)用DNAMAN 軟件預(yù)測(cè)其編碼的氨基酸序列、蛋白分子量、等電點(diǎn)等理化指標(biāo)，運(yùn)用TMHMM 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）軟 件 分析跨膜結(jié)構(gòu)。采用Mega 10 軟件用NJ 法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，通過Turkey 法檢驗(yàn)各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同波長(zhǎng)燈光對(duì)煙草甲的誘集效果

不同波長(zhǎng)燈光對(duì)煙草甲的誘集效果見圖2。煙草甲對(duì)不同波長(zhǎng)光源的趨性存在一定差異。煙草甲對(duì)400～405 nm 波長(zhǎng)的趨性顯著高于對(duì)其他波長(zhǎng)的趨性，趨光率達(dá)74%；對(duì)600～605 nm 波長(zhǎng)的趨性顯著高于對(duì)450～460 nm、515～525 nm 和620～625 nm 波長(zhǎng)的趨性，趨光率為50%左右；而對(duì)450～460 nm、515～525 nm 和620～625 nm 波長(zhǎng)的趨性最差，趨光率分別為35%、37%和35%，且三者間差異不顯著。

2.2 誘蟲燈對(duì)煙草甲的實(shí)倉(cāng)誘捕效果

根據(jù)2.1 節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)煙草甲誘集作用效果最強(qiáng)的400 nm 波長(zhǎng)誘蟲燈進(jìn)行實(shí)倉(cāng)誘捕試驗(yàn)，以380 nm 波長(zhǎng)的誘蟲燈為對(duì)照，觀察該波長(zhǎng)在煙葉倉(cāng)庫(kù)中誘殺煙草甲的效果。結(jié)果表明，400 nm 誘蟲燈對(duì)煙草甲的平均每日誘集量顯著高于380 nm 的誘蟲燈（圖3），其中400 nm 誘蟲燈平均每日誘蟲數(shù)量為632 頭，380 nm 的誘蟲燈平均每日誘蟲數(shù)量?jī)H為286 頭。與室內(nèi)趨光性試驗(yàn)結(jié)果一致。實(shí)倉(cāng)誘捕試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明400 nm 波長(zhǎng)的光源可高效誘集煙草甲。

2.3 煙草甲轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序分析

煙草甲的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果見表1。在煙草甲中共獲得總計(jì)6.49 Gb 的數(shù)據(jù)。組裝并去冗余后得到26 761 條Unigene，總長(zhǎng)度、平均長(zhǎng)度、N50 以及GC 含量分別為36 659 980 bp、1 369 bp、2 376 bp 和43.57%。將Unigene 比對(duì)到功能數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋，最終分別有18 947（NR：70.80%）、6 007（NT：22.45%）、15 000（SwissProt：56.05%）、14 467（KOG：54.06%）、15 336（KEGG：57.31%）、10 256（GO：38.32%）以及15 688（InterPro：58.62%）個(gè)Unigene 獲得功能注釋。使用Transdecoder 檢測(cè)出21 222 個(gè)CDS。同時(shí)還檢測(cè)出2 561 個(gè)SSR 分布于1 994 個(gè)Unigene 中，同時(shí)預(yù)測(cè)出2 915 個(gè)編碼轉(zhuǎn)錄因子的Unigene。表明測(cè)序質(zhì)量較好，數(shù)據(jù)具有可靠性。

表1 煙草甲轉(zhuǎn)錄組的測(cè)序結(jié)果Tab.1 Sequencing results of transcriptome data for Lasioderma serricorne

2.4 煙草甲UV 和LW 視蛋白基因的克隆

通過功能注釋得到兩個(gè)視蛋白基因作為參考序列進(jìn)行基因克?。▓D4），最終獲得了煙草甲UV視蛋白序列（登錄號(hào)為MT040761）和LW 視蛋白序列（登錄號(hào)為MT040760）。序列分析結(jié)果（圖5）顯示，煙草甲UV 視蛋白基因開放閱讀框?yàn)? 182 bp，編碼392 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為43.78 kD，理論等電點(diǎn)為7.95；煙草甲LW 視蛋白基因開放閱讀框?yàn)? 134 bp，編碼376 個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為41.58 kD，理論等電點(diǎn)為8.43。表明煙草甲UV 和LW 視蛋白皆屬于具有7 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的G 蛋白偶聯(lián)受體超家族。

2.5 煙草甲UV 和LW 視蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

蛋白質(zhì)序列比對(duì)結(jié)果（圖6）表明，煙草甲視蛋白序列和其他3 種昆蟲的視蛋白序列一致性均較高。用煙草甲和其他19 種昆蟲的42 個(gè)視蛋白的氨基酸序列構(gòu)建NJ 樹。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果（圖7）表明，煙草甲UV 視蛋白與鞘翅目昆蟲UV 視蛋白匯聚在一起，煙草甲UV 視蛋白的氨基酸序列與一種鞘翅目豉甲科昆蟲Gyrinus marinus的序列一致性最高，同源性約為74%；煙草甲LW 視蛋白與鞘翅目昆蟲LW 視蛋白匯聚在一起，LW 視蛋白的氨基酸序列與基刺瘤木長(zhǎng)蠹（Xylobiops basilaris）的序列一致性最高，同源性約為86%。煙草甲缺失BL 視蛋白，從圖7 可看出，其他幾種鞘翅目昆蟲中也同樣缺失BL 視蛋白。鞘翅目G.marinus、鱗翅目棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）、半翅目煙盲蝽（Nesidiocoris tenuis）、膜翅目蜜蜂（Apis mellifera）和麗蠅蛹集金小蜂（Nasonia vitripennis）皆有兩個(gè)UV視蛋白，鱗翅目海神袖蝶（Heliconius doris）、寬紅袖蝶（Heliconius hortense）以及雙翅目黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）分別有兩個(gè)LW 視蛋白。

3 討論

利用昆蟲的趨光性是害蟲防控的有效依據(jù)，且具有環(huán)境友好的優(yōu)點(diǎn)。近年來，多位學(xué)者對(duì)昆蟲的趨光行為研究發(fā)現(xiàn)，包括光源波長(zhǎng)、昆蟲性別、強(qiáng)度等對(duì)昆蟲趨光行為均有影響［24］。如谷蠹Rhizopertha dominica對(duì)530 nm 綠光和570 nm 黃光趨性最強(qiáng)，并且光強(qiáng)度越大，趨光行為越強(qiáng)［25］；綠盲蝽Apolygus lucorum雌成蟲在562 nm 綠光區(qū)有趨光高峰，但雄成蟲沒有［26］。光源波長(zhǎng)作為影響昆蟲趨光行為的最主要因素，不同昆蟲種類因其生物學(xué)、生態(tài)學(xué)特性不同，對(duì)不同波長(zhǎng)光的選擇也存在差異，多數(shù)昆蟲的敏感波長(zhǎng)在280 ～400 nm的紫外范圍和400 ～700 nm 的可見光范圍內(nèi)［27-28］。本研究中利用7 種波長(zhǎng)LED 燈誘集煙草甲，發(fā)現(xiàn)煙草甲對(duì)400 ～405 nm 波長(zhǎng)（紫光）的趨性最強(qiáng)，對(duì)600 ～605 nm 波長(zhǎng)（橙光）的趨性次之。與Katsuki等［12］試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的紫光和藍(lán)光效果最好的研究結(jié)果稍有不同，本試驗(yàn)中450 ～460 nm（藍(lán)光）誘集效果一般，可能與Katsuki 等使用藍(lán)光LED 的光強(qiáng)不同有關(guān)。本研究中實(shí)倉(cāng)誘捕試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明，400 nm 波長(zhǎng)的光源可高效誘集煙草甲，綜合前人研究結(jié)果來看，煙草甲對(duì)紫光趨性最強(qiáng)，與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致［9-13］。

昆蟲趨光行為復(fù)雜，視蛋白是接受光刺激的關(guān)鍵分子，影響多種昆蟲的光誘導(dǎo)行為，深入分析煙草甲視蛋白對(duì)揭示其趨光機(jī)理具有重要意義。盡管多數(shù)昆蟲存在UV、BL 和LW 3 種視蛋白，但在一些鞘翅目昆蟲中缺失BL 視蛋白，煙草甲同樣缺失BL 視蛋白，且煙草甲對(duì)450 ～460 nm（藍(lán)光）的趨性較差。已有的研究發(fā)現(xiàn)，鞘翅目昆蟲可通過UV 和LW 視蛋白基因復(fù)制中各位點(diǎn)的改變，重建其對(duì)于藍(lán)光波長(zhǎng)的敏感性［29］，且在赤擬谷盜中得到了證實(shí)［30］。而一些學(xué)者對(duì)昆蟲視蛋白的表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）敲除LW 視蛋白后綠光對(duì)其吸引力降低［31］；柑橘木虱（Diaphorina citri）的UV、BW 和LW 視蛋白在白天具有較高的表達(dá)水平，降低視蛋白的表達(dá)水平則抑制其趨光行為［32］。說明視蛋白的表達(dá)水平與昆蟲趨光行為呈正相關(guān)［14］。本研究中煙草甲對(duì)400～405 nm 和600 ～605 nm 波長(zhǎng)的趨光行為，與UV視蛋白和LW 視蛋白對(duì)波長(zhǎng)敏感范圍一致，煙草甲的趨光行為可能與UV 視蛋白的高表達(dá)水平有關(guān)，但煙草甲在應(yīng)對(duì)不同波長(zhǎng)光源時(shí)的視蛋白表達(dá)量變化還有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

煙草甲有兩個(gè)與敏感光吸收相關(guān)的視蛋白，分別為UV 視蛋白和LW 視蛋白。煙草甲對(duì)不同波長(zhǎng)光源的趨性存在差異，對(duì)400 ～405 nm 趨性最強(qiáng)，對(duì)600 ～605 nm 趨性次之。400 nm 波長(zhǎng)的誘蟲燈可用于煙葉倉(cāng)庫(kù)中煙草甲的誘殺防治。