郭康康，崔 歡，張 誠(chéng)，張 博，陳立功，劉聚祥，董世山

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院, 河北 保定 071001；2. 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病病原生物學(xué)華北科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站， 河北 保定 071001；3. 河北省獸醫(yī)生物技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 保定 071001）

H7N9 亞型禽流感病毒（Avain influenza virus，AIV）是由8 個(gè)基因片段組成的單鏈負(fù)股RNA 病毒［1］。根據(jù)致病性的高低，可分為高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic AIV，HPAIV）和低致病性禽流感病毒（Low pathogenic AIV，LPAIV），血凝素（Hemagglutinin，HA）是AIV 粒子表面最豐富的蛋白， 是影響病毒致病力和宿主范圍的主要因素， 可以介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞受體的結(jié)合［2］。野禽被認(rèn)為是AIV 的天然宿主，當(dāng)LPAIV 由野禽傳播到家禽時(shí)， 在HA 中引入多個(gè)堿性氨基酸殘基發(fā)生變異， 轉(zhuǎn)化為HPAIV［3］。近年來(lái)研究證明AIV 的聚合酶B2（Polymerase B2，PB2）、聚合酶B1（Polymerase B1， PB1）和聚合酶A（Polymerase A，PA）蛋白發(fā)生適應(yīng)性位點(diǎn)突變是AIV 跨物種傳播并適應(yīng)新宿主的一種重要方式，其中PB2 蛋白上關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)突變是影響病毒致病性的重要因素，涉及到的位點(diǎn)如：E627K、E158G、A558V、D701N 等［4］。隨著研究的深入，AIV 中越來(lái)越多的蛋白適應(yīng)性位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)，為研究預(yù)防和治療禽流感藥物提供了技術(shù)保障。

1997 年，我國(guó)香港首次報(bào)道了H5N1 AIV 感染人的事件，隨后H9N2、H7N3 等感染人的事件陸續(xù)發(fā)生［5］。2013 年，在我國(guó)上海出現(xiàn)首例人感染H7N9 案例，隨后安徽、江蘇、浙江等省份相繼發(fā)生， 養(yǎng)禽業(yè)也發(fā)生感染H7N9 亞型禽流感案例，不僅給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，也對(duì)人類(lèi)公共衛(wèi)生安全帶來(lái)前所未有的挑戰(zhàn)［6］。人群中散發(fā)性的出現(xiàn)H7N9 亞型禽流感感染事件，大多具有家禽或者活禽交易市場(chǎng)暴露史，為H7N9 AIV 從禽類(lèi)直接跨物種傳染給人類(lèi)提供了重要的潛在可能。

本研究通過(guò)對(duì)1 株H7N9 亞型禽流感病毒基因測(cè)序和序列分析，研究AIV 遺傳進(jìn)化規(guī)律，了解其內(nèi)部蛋白氨基酸位點(diǎn)變化，為禽流感防控提供了可靠依據(jù)。

1 材料方法

1.1 主要試劑

RNA 提 取 試 劑 盒（RNeasy Micro Kit）購(gòu) 自QIAGEN 公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Magen 公司；反轉(zhuǎn)錄酶及其Buffer、dNTP、RNA 酶抑制劑、ExTaq 聚合酶及其Buffer、DL-2000 Marker 購(gòu)自 TaKaRa 公司；隨機(jī)引物，反轉(zhuǎn)錄引物，流感通用擴(kuò)增引物由工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病毒基因組片段的擴(kuò)增 嚴(yán)格按照QIAGEN 公司的RNA 提取試劑盒說(shuō)明提取RNA。以病毒RNA 為模板，參照寶生物相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制體系為20 μL，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以病毒cDNA 為模板，用流感通用引物擴(kuò)增8 個(gè)基因片段，由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)定基因序列。

1.2.2 基因序列分析 將禽流感8 個(gè)基因片段PB1、PB2、PA、HA、NA、 非 結(jié) 構(gòu) 蛋 白（Nonstructural Protein，NS）、基質(zhì)蛋白（Matrix Protein， M）、核蛋白（Nucleoprotein，NP）序列分別在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）進(jìn)行核苷酸序列Blast 分析。從全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織（Global Initiative on Sharing All influenza Data， GISAID） 數(shù) 據(jù) 庫(kù)下載人源H7N9 病毒HA、NA 序列。使用MEGA 6. 0 軟件，進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。用NetNGlyc 1.0 Server 進(jìn)行序列氨基酸位點(diǎn)分析。其中，人源流感 參 考 毒 株 為A/Wuxi/3/2013（H7N9）， ID 為EPI_ISL_153008。禽源流感參考毒株為A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）， 基 因PB2、PB1、PA、NP、HA、NA、M、NS 的GenBank 登錄號(hào) 分 別 為KJ549783.1、KJ549784.1、KJ549785.1、K J 5 4 9 7 8 7.1、K J 5 4 9 7 8 6.1、K J 5 4 9 7 8 8.1、KJ549789.1、KJ549790.1、KJ549787.1、KJ549786.1、KJ549788.1、KJ549789.1、KJ549790.1。

2 結(jié)果與分析

2.1 禽流感病毒基因組片段的擴(kuò)增

通過(guò)RT-PCR 方法擴(kuò)增1 株AIV 的8 個(gè)基因片段（圖1），測(cè)序得到8 個(gè)基因組序列。將序列在NCBI 上進(jìn)行Blast 分析，確定為H7N9 亞型禽流感病毒并命名為A/environment/Hebei/621/2017（H7N9），簡(jiǎn)稱(chēng)EN621。

2.2 同源性分析

EN621 毒株8 個(gè)基因序列經(jīng)NCBI 中Blast 分析，結(jié)果顯示該病毒8 個(gè)基因片段均與H7N9 亞型禽流感病毒高度同源，相似度均在99% 以上（見(jiàn)表1）。

圖1 EN621 毒株8 個(gè)基因片段的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 1 PCR products of eight genes of EN621

表1 EN621 毒株8 個(gè)基因片段核苷酸同源性分析Table 1 Nucleotide homology analysis of eight genes of EN621

2.3 HA 和NA 遺傳進(jìn)化分析

根據(jù)HA 和NA 遺傳進(jìn)化分析（見(jiàn)圖2），其中與EN621 毒株HA 基因同源性最高的毒株是A/chicken/Henan/HNXY1/2017（H7N9），同源率為99.69%， EN621 毒株HA 基因與A/chicken/Guangdong/SD103/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/GD15/2016（H7N9）、A/chicken/Guangdong/HP001/2017（H7N9）、A/chicken/Jiangsu/19757/2015（H7N9） 和A/chicken/Jiangsu/18828/2014（H7N9）等珠江三角洲地域毒株屬于同一進(jìn)化支進(jìn)化而來(lái)。EN621 毒株HA 基因與人源流感毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）、A/Jiangsu/18828/2014（H7N9）、A/Jiangsu/19757/2015（H7N9） 同 源 率 分 別 為97.12%、97.36% 和97.42%。

EN621 毒株NA 基因同源率最高的毒株是A/chicken/Guangdong/S11523/2017（H7N9），同源率為99.71%， EN621 毒株NA 基因與A/chicken/Guangdong/SD156/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/SD11523/2017（H7N9）、A/chicken/Guangdong/SD010/2017（H7N9）、A/Jiangsu/19758/2015（H7N9）、A/Jiangsu/60466/2016（H7N9）等珠江三角洲地域毒株屬于同一進(jìn)化支進(jìn)化而來(lái)。EN621 毒株NA 基因與人源流感毒株A/Jiangsu/19758/2015（H7N9）、A/Jiangsu/60466/2016（H7N9）、A/Jiangsu/03/2013（H7N9）、A/Nanjing/M2/2013（H7N9）同源率分別為98.38%、96.84%、97.28%、97.92%。結(jié)果顯示，EN621 可能來(lái)源于珠江三角洲譜系，屬于歐亞型；其HA 和NA 均與2013 年至2016 年人源H7N9 相對(duì)應(yīng)片段相似度較高，推測(cè)其傳播宿主由禽傳播到人后再傳播到禽，進(jìn)一步在禽內(nèi)傳播。

圖2 HA、NA 基因進(jìn)化樹(shù)Fig. 2 Evolutionary tree of HA, NA genes

2.4 HA 和NA 蛋白的相關(guān)糖基化位點(diǎn)分析

HA 蛋白氨基酸序列分析結(jié)果表明，共計(jì)編碼564 個(gè)氨基酸， 具有5 個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，其中與人源參考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的HA 蛋白和禽源參考毒株A/chicken/Shanghai/PDCN-02/2014（H7N9）的HA 蛋白對(duì)比發(fā)現(xiàn)。EN621 毒株的HA 蛋白的裂解位點(diǎn)處有多個(gè)連續(xù)堿性氨基酸 PKRKRTARGLF，符合典型高致病性AIV 分子特征， HA 受體結(jié)合位點(diǎn)226 位為谷氨酰胺（Q）未發(fā)生突變，優(yōu)先與禽類(lèi)的特異性受體結(jié)合（見(jiàn)表2）。

表2 HA 蛋白糖基化位點(diǎn)分析Table 2 Analysis of glycosylation sites of HA proteins

NA 蛋白氨基酸序列分析結(jié)果表明，共計(jì)編碼465 個(gè)氨基酸，具有6 個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，其中與人源參考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的NA 蛋白和禽源參考毒株A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）NA 蛋白對(duì)比發(fā)現(xiàn)，EN621 毒株NA 蛋白上與耐藥性有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)119E、152R、274H、292R、294N 未突變，不產(chǎn)生耐藥性（見(jiàn)表3）。

表3 NA 蛋白糖基化位點(diǎn)分析Table 3 Analysis of glycosylation sites of NA proteins

2.5 內(nèi)部蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)分析

EN621 毒株內(nèi)部蛋白與人源參考毒株A/Wuxi/3/2013（H7N9）的內(nèi)部蛋白和禽源參考毒株A/chicken/Shanghai/PD-CN-02/2014（H7N9）內(nèi)部蛋白對(duì)比發(fā)現(xiàn)， EN621 毒株P(guān)A 蛋白上對(duì)小鼠致病性有影響以及對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒復(fù)制有關(guān)的關(guān)鍵氨基酸224S、615K、638R、638R 和539K 等均未突變。EN621 毒株P(guān)B2 蛋白上對(duì)病毒的復(fù)制、致病性或跨宿主傳播能力等起決定性作用關(guān)鍵氨基酸627E、701D、714S、591Q、590G、158E 等均未突變。EN621 毒株P(guān)B1 蛋白上對(duì)影響聚合酶活性的關(guān)鍵氨基酸677T 和678S 未發(fā)生突變。EN621 毒株NP 蛋白上對(duì)AIV 的復(fù)制和致病性有著密切聯(lián)系的關(guān)鍵氨基酸第184 位由A 突變?yōu)镵。EN621 毒株NS1 蛋白與耐藥性相關(guān)的位點(diǎn)92D 未發(fā)生突變。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)HA 和NA 基因的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析顯示， 本研究中的H7N9 AIV 與2013 年無(wú)錫分離到的人源流感毒株相近， 推測(cè)可能為2013 年人源流感毒株與其他亞型禽流感毒株重組進(jìn)化而來(lái)，在禽群中傳播。近年來(lái)研究表明AIV 在家禽和野生禽類(lèi)體內(nèi)不斷重組，使其具有高致病性和傳播性的潛在可能［7-8］。M、PB1、PB2 基因與H9N2 亞型禽流感毒株相應(yīng)基因片段高度同源，同時(shí)M 基因與湖北、廣東、江蘇等南方地區(qū)分離的H9N2 AIV 的M 基因處于同一進(jìn)化支，NP 基因與H6N6，H9N2 等多個(gè)亞型禽流感毒株NP 基因高度同源，且宿主來(lái)源廣泛， 地域上多為長(zhǎng)江和珠江三角洲地區(qū)，說(shuō)明EN621 毒株是家禽和野生水禽等不同宿主來(lái)源的基因重組進(jìn)化而來(lái)， 珠江三角洲和長(zhǎng)江三角洲兩地域是禽流感病毒的重組和傳播的重要場(chǎng)所，推測(cè)有可能起源于珠江三角洲［9-10］。遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明本研究毒株并未發(fā)生較大變異，當(dāng)前疫苗依舊可以預(yù)防，但仍要注意生物安全，防患于未然。

已報(bào)道的研究證實(shí)，PB2 蛋白上某些氨基酸的改變是影響AIV 致病性的重要因素，如PB2 蛋白中第627 位氨基酸由E 突變?yōu)镵，是最常見(jiàn)的哺乳動(dòng)物適應(yīng)性位點(diǎn)突變，且該位點(diǎn)在H10N8、H7N9、H3N2 等多種亞型AIV 中可檢測(cè)到，EN621 毒株P(guān)B2 蛋白的627 位氨基酸為E 未發(fā)生突變［11-14］。近年報(bào)道H9N2 禽流感病毒的PB2 的D253N 突變， 可增強(qiáng)對(duì)小鼠的致病性，而EN621 毒株P(guān)B2 蛋白D253N 未突變［15-16］。EN621 毒株NP 蛋白關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)第184 位由A 突變?yōu)镵，有報(bào)道稱(chēng)此位點(diǎn)突變與AIV 的復(fù)制和致病性有著密切聯(lián)系，EN621 毒株P(guān)A 蛋白上影響聚合酶活性的510H 未突變［17］。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，NS1 蛋白的D92E 位點(diǎn)突變會(huì)造成流感病毒對(duì)人的致病性增強(qiáng)，也會(huì)對(duì)細(xì)胞因子如 IFN 的抗病毒耐藥性產(chǎn)生影響但本研究中的EN621 毒株NS1 蛋白的92D 未突變［17-18］。

本研究中的H7N9 AIV 為高致病性歐亞型禽流感毒株，HA 和NA 基因片段與人源流感毒株同源性較高，NP、M、PB1 等基因與多個(gè)亞型禽流感毒株高度同源，具有感染人的潛在可能，建議加強(qiáng)對(duì)H7N9 AIV 的監(jiān)測(cè)，并對(duì)家禽做好相應(yīng)的免疫計(jì)劃，建立長(zhǎng)期有效的防控機(jī)制。