張新超，張新宇，唐 敏，張雪梅,3,4，李 寒,3,4，齊國輝,3,4

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定071000; 2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830091；3.河北省核桃工程技術(shù)研究中心，河北 臨城 054300；4.河北省(邢臺）核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北 臨城 054300)

核桃（Julans Regia L.）又稱胡桃、羌桃，屬胡桃科胡桃屬，原產(chǎn)于我國，是栽培歷史悠久的重要經(jīng)濟林樹種之一［1］。當(dāng)前核桃普遍采用的育苗方法是方塊形芽接嫁接繁育，需2 ～3 年出圃，產(chǎn)苗量低，繁殖系數(shù)低；同時核桃嫁接用的砧木一般采用實生繁殖，需要大量的優(yōu)質(zhì)核桃種子，因此，相對于其他樹種，核桃嫁接育苗成本很高。組織培養(yǎng)育苗具有繁殖系數(shù)高、速度快等優(yōu)點，已經(jīng)在甜櫻桃、軟棗獼猴桃［2-3］等經(jīng)濟林樹種上應(yīng)用；且組織培養(yǎng)還可以用于育種、轉(zhuǎn)基因、植物生理代謝等方面的研究。在植物組織培養(yǎng)過程中激素起著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源激素IAA 對根原基的發(fā)育、生長有誘導(dǎo)作用［4］。GA3是通過改變根內(nèi)皮層細胞分裂和伸長的速度，來影響根中其他細胞的分裂和伸長［5］。ABA 是生長抑制激素，在植物體內(nèi)起到負調(diào)控作用［6］。ZT 促進細胞質(zhì)的分裂的同時對植物的芽生長、分化有較大影響［7］。組培苗瓶內(nèi)生根階段，生根培養(yǎng)基中需添加生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑，多以IBA 為主，其次是K-IBA［8-9］，外源生長調(diào)節(jié)劑通過調(diào)控內(nèi)源激素來誘導(dǎo)外植體形成不定根。因此，研究植物組織培養(yǎng)過程內(nèi)源激素含量變化，對探究內(nèi)源激素調(diào)控組培苗的不定根形成與分化具有重要意義?，F(xiàn)在美國一些實驗室已經(jīng)將組織培養(yǎng)方法獲得的優(yōu)質(zhì)核桃砧木苗應(yīng)用于大田生產(chǎn)，國內(nèi)也逐步提高經(jīng)濟林苗木組織培養(yǎng)技術(shù)［10-11］，本試驗研究了外源生長調(diào)節(jié)劑 K-IBA 和IBA 處理對‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根的影響及瓶內(nèi)生根過程中內(nèi)源激素的變化，旨在探討其組培生根機理，為核桃的高效栽培提供無性繁殖理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

‘綠嶺’核桃繼代組培苗（高度為4 ～6 cm）。

1.2 試驗方法

1.2.1 生根試驗設(shè)計 采用隨機區(qū)組設(shè)計，共6 個處理，分別為：處理1（D1），K-IBA 5 mg/L；處理2（D2），K-IBA 10 mg/L；處理3（D3），K-IBA 15 mg/L；處理4（D4），IBA 1 mg/L；處理5（D5），IBA 3 mg/L；處理6（D6），IBA 5 mg/L，基本培養(yǎng)基為1/2 DKW，蔗糖40 g/L，瓊脂2.28 g/L。每20 瓶為一小區(qū)，每個處理重復(fù) 3 次，每瓶接種3 棵組培苗。

1.2.2 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度(27±2) ℃，光強度2 000 Lx，光照時間15 h/d。

1.2.3 生根過程觀察及取樣方法 接種后放入紙箱，進行暗培養(yǎng)，每天進行1 次照光、每次1 h，20 d 后轉(zhuǎn)移到普通日光燈下進行光照培養(yǎng)；每隔10 d 進行1 次生根形態(tài)統(tǒng)計，分別記錄愈傷組織出現(xiàn)期、不定根出現(xiàn)期和發(fā)生的部位以及根系的生長過程；培養(yǎng)50 d 后統(tǒng)計組培苗生根率、根長、根系直徑。接種后當(dāng)天取樣1 次，光照培養(yǎng)期間每隔10 d 從各處理中取樣1 次，共計5 次。從每個重復(fù)中隨機抽取5 棵組培苗，迅速用蒸餾水將根部沖洗干凈（20 d生根苗的韌皮部和愈傷組織、30 d 愈傷組織和少量根尖、40 d 根尖和少量根樣及50 d 根樣），濾紙擦干，然后將根系剪碎混勻后用液氮速凍，放于-80 ℃冰箱中保存待測；接種0 d 的采集無根組培苗基部1 cm 的皮層用于測定內(nèi)源激素。

1.2.4 內(nèi)源激素測定方法 稱取樣品1 g，用6 mL 80% 的預(yù)冷色譜甲醇研磨成粉于離心管中，4 ℃ 12 000 r/min 離 心10 min，加 入0.03 g 抗 氧 化 劑（PVPP），4 ℃ 8 000 r/min 離心5 min，4 ℃避光浸提12 h。取1 mL 上清液，3 mL 1%冰乙酸（超凈水配制），將4 mL 混合液倒入C18 小柱濾出，加5 mL 10%甲醇再濾出，加1 mL（含5 g/L 80%甲醇）混合液并收集，用0.45 μm 的微孔濾膜過濾打入進樣瓶用于檢測。用流速Waters1525 高效液相色譜儀［12-13］測定IAA、GA3、ABA 和ZT 的含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理、圖表制作運用 Excel 2007。SPSS 22.0 進行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根的影響

不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根的影響見表1。從表1 中可看出，隨K-IBA濃度的增加，組培苗的生根率先降低后升高，根的長度呈升高趨勢，根系直徑先升高后降低。隨著IBA 濃度的增加，組培苗的生根率和根長先升高后降低，根系直徑呈升高趨勢。D3 處理生根率、平均根長及根系活力達最高，分別為51.85%、26.87 mm及47.37 μg/g·TTF，極顯著高于其他處理（P＜0.01）。D5、D6 處理根系直徑依次為3.80 和3.94 mm，極顯著高于其他處理。由此可見，D3（即K-IBA 濃度為15 mg/L）處理植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根生長有顯著影響，生根情況最好。

表1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理下‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根及形態(tài)情況Table 1 Roots and morphology of the ‘Lvling’ walnut in vitro rooting seedlings under different plant growth regulators

2.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根進程形態(tài)觀察

不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根進程基部形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，暗培養(yǎng)20 d 后，各處理組培苗基部皮孔膨大外凸、呈開裂跡象，少量愈傷組織開始出現(xiàn)（如圖2A、D 所示）；到30 d（光照10 d 后）愈傷組織逐漸膨大，愈傷組織基部有白色突起（如圖2B 所示）；40 d 時D6 處理根長32.51 mm（如圖1E 所示），因此在生根培養(yǎng)40 d前已有少量根原基的形成40 d 后不定根逐漸伸長；生根培養(yǎng)50 d 時D6 不定根根長達47.32 mm（如圖1F 所示）。觀察發(fā)現(xiàn)，K-IBA 處理組培苗培養(yǎng)23 d前后開始生根，愈傷組織多；IBA 處理組培苗培養(yǎng)28 d 前后開始生根，根系生長快且根粗。

圖1 ‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根進程Fig.1 Rooting process of ‘Lvling’ walnut tissue culture seedlings

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根過程內(nèi)源激素含量的影響

2.3.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對IAA 含量變化 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根過程中IAA 含量變化的影響如圖2 所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，各處理IAA 含量呈現(xiàn)降低—升高—降低的變化趨勢。0 d 的IAA 含量為186.49 μg /g·FW。D1、D3、D6 處理的IAA 含量在培養(yǎng)30 d 時達到最高值，D2、D5 處理40 d 時達到最高值。30 d 時D3處理IAA 含量最高，為221.34 μg /g·FW，極顯著高于其他處理。40 d 時D2、D3 處理IAA 含量分別為204.80 μg /g·FW、194.89 μg/g·FW，極顯著高于其他處理。由此可見，D3（即K-IBA 濃度為15 mg/L）處理對‘綠嶺’核桃組培苗內(nèi)源激素IAA 含量有顯著影響，IAA 含量在20 ～30 d 時迅速升高，組培苗開始生根。

圖2 ‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根過程中IAA 含量變化Fig.2 Changes of IAA content in ‘Lvling’ walnut tissue culture seedlings during in vitro rooting process

2.3.2 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對GA3 含量變化 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根過程中GA3含量變化的影響如圖3 所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，D1 ～D3、D5、D6 處理GA3含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢，D4 處理呈現(xiàn)降低的變化趨勢。D1 ～D4 處理GA3含量在培養(yǎng)20 d 時達到最高值，D5、D6 處理30 d 時達到最高值。0 d 的GA3含量為548.84 μg/g·FW。20 d 時D3 處理GA3含量最高，為1 945.55 μg/g·FW，極顯著高于其他處理。30 d時D6 處理GA3含量最高，為965.01 μg/g·FW，極顯著高于其他處理。由此可見，D3、D6（即K-IBA濃度為15 mg/L、IBA 濃度為5 mg/L）處理植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗內(nèi)源激素GA3含量有顯著影響，其中D3 處理GA3含量在培養(yǎng)0 ～20 d 時升高，組培苗愈傷組織迅速生長；D6處理GA3含量在培養(yǎng)20 ～30 d 時升高，組培苗愈傷組織生長。

圖3 ‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根過程中GA3 含量變化Fig.3 Changes of GA3 content of ‘Lvling’ walnut tissue culture seedlings during in vitro rooting process

圖4 ‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根過程中內(nèi)源激素（ZT）含量的變化Fig.4 The changes of ZT content of ‘Lvling’ walnut tissue culture seedlings during in vitro rooting process

2.3.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對ZT 含量變化 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根過程中ZT含量變化的影響如圖4 所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，D1 ～D4、D6 處理ZT 含量呈現(xiàn)升高后降低的變化趨勢，D5 處理呈現(xiàn)降低—升高—降低的變化趨勢。0 d 的ZT 含 量 為36.28 μg/g·FW。D1、D2、D5 處理ZT 含量在培養(yǎng)20 d 時達到最高值，D3、D4、D6 處理30 d 時達到最高值。20 d 時D1 ～D3 處理ZT 含量依次為116.76、117.00、120.33 μg/g·FW，極顯著高于D4 ～D6 處理。30 d 時D3 處理ZT 含量最高，為127.50 μg/g·FW，極顯著高于其他處理。由此可見，D3（即K-IBA 濃度為15 mg/L）處理植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗內(nèi)源激素ZT 含量有顯著影響，ZT 含量在培養(yǎng)0 ～30 d時不斷升高，組培苗愈傷組織省長且開始生根，生根率最好。2.3.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對ABA 含量變化 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根過程中ABA 含量變化的影響如圖5 所示，隨著培養(yǎng)時間的延長，D1 ～D3、D5、D6 處理ABA 含量呈現(xiàn)升高后降低的變化趨勢，D4 處理呈現(xiàn)降低后升高的變化趨 勢。0 d 的ABA 含 量 為8.47 μg/g·FW。D4 處 理ABA 含量在培養(yǎng)40 d 時達到最低值，D1 ～D3、D5、D6 處理50 d 時達到最低值。20、30、40 d 時D4 處理ABA 含量均最低，分別為8.20、5.19 和5.12 μg/g·FW，且極顯著低于其他處理。50 d 是D3、D4、D6 處理ABA 含量依次為5.55、6.66 和6.58 μg/g·FW，極顯著低于其他處理。由此可見，D4（即IBA 濃度為1 mg/L）處理植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃組培苗內(nèi)源激素ABA 含量有顯著影響，該處理的ABA 含量在培養(yǎng)期間都很低，組培苗生長情況最好，但是生根效果不好。

圖5 ‘綠嶺’核桃組培苗瓶內(nèi)生根過程中ABA 含量變化Fig.5 Changes of ABA content of ‘Lvling’ walnut tissue culture seedlings during in vitro rooting process

2.3.5 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對IAA/ZT 值變化 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃內(nèi)生根過程中IAA/ZT 值變化的影響如圖6 所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，D1 ～D3 處理IAA/ZT 比值呈現(xiàn)降低—升高—降低的變化趨勢，D4 ～D6 處理呈降低后升高趨勢。0 d 的IAA/ZT 比值均為5.14。D1 ～D3 處理IAA/ZT 比值在培養(yǎng)40 d 時達到最高值。30 d 時D2、D3處理IAA/ZT 比值分別為1.72、1.74，極顯著高于其他處理。40 d時D2、D3處理IAA/ZT比值分別為3.19、2.85，極顯著高于其他處理。在培養(yǎng)30 ～40 d 時，D2、D3 處理組培苗IAA/ZT 比值高，組培苗根系活力高；在培養(yǎng)期間D4 處理IAA/ZT 比值均極顯著低于其他處理，組培苗生長情況最好。

圖6 ‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根過程中內(nèi)源激素（IAA/ZT）含量的變化Fig.6 The changes of IAA/ZT ratio of ‘Lvling’ walnut tissue culture seedlings during in vitro rooting process

2.3.6 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對IAA/ABA 值變化 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根過程中IAA/ABA 值變化的影響如圖7 所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，D1 ～D4 處理IAA/ABA 比值呈現(xiàn)降低—升高—降低的變化趨勢，D5、D6 處理呈現(xiàn)降低后升高的變化趨勢。0 d 的IAA/ABA 比值為22.02。D2 ～D4 處理30 d 時達到最高值，D1 處理40 d 時達到最高值。20 d 時D3、D5、D6 處理IAA/ABA比值依次為6.33、6.96、6.35，極顯著高于D1、D2、D4 處 理。30 d、40 d 時D3 處 理IAA/ABA 比值均最高，分別為19.59、14.51，且極顯著高于其他處理。D3、D4 處理培養(yǎng)20 ～30 d 時IAA/ABA比值升高，其中D3 處理愈傷組織生長且部分組培苗長出根尖；D4 處理在經(jīng)過10 d 的暗培養(yǎng)后組培苗生長情況好。

圖7 ‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根過程中內(nèi)源激素（IAA/ABA）含量的變化Fig.7 The changes of IAA/ABA ratio of ‘Lvling’ walnut tissue culture seedlings during in vitro rooting process

3 討論

組培苗瓶內(nèi)生根階段，生根培養(yǎng)基中添加生長素類植物生長調(diào)節(jié)劑，隨著各處理組培苗生根變化，內(nèi)源激素含量隨之發(fā)生變化［14-15］。植物生長調(diào)節(jié)劑濃度對不同植物種類生根情況的影響存在一定的差異，當(dāng)添加的植物生長調(diào)節(jié)劑濃度過高時，會抑制內(nèi)源激素含量的產(chǎn)生，從而影響到細胞分裂與分化［16-18］。陳凌艷等［19］在研究IBA 對西洋杜鵑組培苗生根處理的影響時發(fā)現(xiàn)IBA 對生根有明顯的促進作用，即IBA 濃度升高組培苗生根數(shù)量也會增加，但過高的IBA濃度會產(chǎn)生一定的抑制作用。李代麗［20］利用IBA 處理白刺組培苗，1.0 mg/L IBA 處理能較好的促進愈傷組織的形成，提高內(nèi)源激素的含量，進而有利于組培苗的生長及愈傷組織的分化效果。

本研究發(fā)現(xiàn)，適宜濃度的K-IBA 與IBA 處理對組培苗的生根率和根長及根系直徑都具有顯著促進作用。組培苗生根培養(yǎng)后隨著K-IBA 濃度升高，生根率、根長及根系活力都明顯提高，說明K-IBA 能增強生根苗內(nèi)細胞的代謝過程，促進根原基的誘導(dǎo)和形成，進而促進生根?！G嶺’核桃組培苗發(fā)根部位為愈傷組織周圍，組培苗瓶內(nèi)生根培養(yǎng)0 ～20 d左右K-IBA 處理和高濃度的IBA 處理生根組培苗愈傷組織不斷生長。K-IBA 處理培養(yǎng)20 d 后所有幼苗下端均可形成愈傷組織，培養(yǎng)23 d 左右部分組培苗愈傷組織周圍有白色根尖凸出，20 ～30 d 為生根的高峰期，30 ～40 d 期間根不斷伸長、加粗，其中15 mg/L K-IBA 處理組培苗生根效果最好；IBA 處理培養(yǎng)25 d 后所有幼苗下端均可形成愈傷組織，培養(yǎng)28 d 左右部分組培苗愈傷組織周圍有白色根尖凸出，25 ～35 d 為生根的高峰期，40 d 后不再生根，其中1 mg/L IBA 濃度處理組培苗生長情況最好但是生根效果最不理想。植物生長調(diào)節(jié)劑通過影響內(nèi)源激素含量的動態(tài)變化，進而調(diào)控組培苗不定根的形成，與裴東［21-23］等研究發(fā)現(xiàn)一致。 高濃度K-IBA處理生根組培苗內(nèi)源激素IAA 含量高于IBA 處理，說明適宜濃度的K-IBA 處理有利于IAA 的合成。在組織培養(yǎng)中，赤霉素與生長素共同誘導(dǎo)木質(zhì)部與韌皮部的分化，但與生長素不同，GA3對生根苗不定根伸長產(chǎn)生了抑制作用［24-25］，因此在培養(yǎng)0 ～20 d時10 mg/L K-IBA、15 mg/L K-IBA 處理生根組培苗GA3含量上升，愈傷組織生長；在培養(yǎng)30 ～50 d時各處理生根組培苗GA3含量逐漸下降，不定根逐漸伸長。15 mg/L K-IBA 處理IAA/ABA 比值和IAA/ZT 比值均高，說明適宜濃度植物生長調(diào)節(jié)劑處理組培苗生根能力強，有利于根系的分化。1 mg/L IBA 處理生根組培苗IAA/ABA 比值高但IAA/ZT 比值低，說明植物生長調(diào)節(jié)通過影響ABA、ZT 的合成來促進生根組培苗的生長。綜上所述，‘綠嶺’核桃瓶內(nèi)生根的最佳植物生長調(diào)節(jié)劑為K-IBA，適宜的濃度為15 mg/L，經(jīng)過該處理的生根苗內(nèi)源激素的動態(tài)變化，說明有利于愈傷組織的生長，可以共同調(diào)控組培苗不定根的形成。