武怡荷，楊繼業(yè)，陳書明，張希春，陳亞偉，王軍艷，趙蘇蘇，呂 冰

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西晉中 030619；3.山西省畜牧遺傳育種中心，山西太原 030027）

雞大腸桿菌是一種條件致病菌，其血清型眾多，臨床病型復(fù)雜，傳染性強(qiáng)[1]。隨著養(yǎng)雞業(yè)的規(guī)?；?，該病常造成雞只發(fā)病死亡，使其生產(chǎn)性能大大降低，給養(yǎng)雞業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，國內(nèi)外治療用藥主要有氟苯尼考、諾氟沙星等抗生素[2-3]，但存在以下缺點(diǎn)：（1）在畜禽產(chǎn)品中有害藥物殘留量大，導(dǎo)致很多食品安全問題的發(fā)生；（2）長期應(yīng)用，會產(chǎn)生耐藥菌。所以，老疫區(qū)靠抗生素等西藥很難有效控制疫情，因而常有大規(guī)模的疫情發(fā)生、蔓延，給養(yǎng)雞業(yè)造成致命打擊。因此，研制安全、高效的防治禽大腸桿菌病的藥物是當(dāng)代獸醫(yī)工作者急需解決的重大課題。

近年來，大量研究發(fā)現(xiàn)，清熱類與補(bǔ)益類中草藥可通過直接清除大腸桿菌毒素、影響大腸桿菌核酸或蛋白的合成與代謝或調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能治療禽大腸桿菌病，其在臨床應(yīng)用中具有廣闊前景[4-6]。山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院中獸藥研發(fā)團(tuán)隊(duì)與山西偉業(yè)生物技術(shù)有限公司合作，根據(jù)中醫(yī)中藥理論及多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，以穿心蓮、白扁豆、黨參、蒼術(shù)、秦皮等為基礎(chǔ)，研制出對雞大腸桿菌病有較好療效的復(fù)方中藥。筆者就該復(fù)方中藥對大腸桿菌的抑菌效果、雞大腸桿菌病的療效以及雞紅細(xì)胞免疫指標(biāo)的影響、藥物安全性進(jìn)行了初步研究，旨在探索該復(fù)方中藥扶正固本，清熱解毒的機(jī)制，為防治雞大腸桿菌病中藥制劑研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

復(fù)方中藥：根據(jù)中醫(yī)中藥配伍原則，由穿心蓮、白扁豆、黨參、蒼術(shù)、秦皮等配伍而成，由山西偉業(yè)生物技術(shù)有限公司提供。

實(shí)驗(yàn)動物：KM小鼠（18～22 g），購自山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物合格證號：SCXK（晉）2015-0001。

氟苯尼考（100 g 含氟苯尼考30 g）由廣州市匯邦動物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病例來源與診斷 2020 年4 月，文水某雞場4 周齡雞群患病，病雞精神不振，食欲減退，拉黃白色稀便且肛門被糞便污染，部分雞腳麻痹，每天死亡5～6 只。剖解死亡病雞可見，肝臟腫大變脆，腹腔中有少量黃色滲出物，腸粘膜充血、出血。采集死亡不久的完整雞肝臟，在無菌環(huán)境中使用肝臟切面涂布普通培養(yǎng)基與麥康凱培養(yǎng)基。普通培養(yǎng)基生長出濕潤、光滑的圓形半透明菌落；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上出現(xiàn)圓形紅色菌落；經(jīng)生化鑒定試驗(yàn)[7]，鑒定為大腸桿菌。根據(jù)流行病學(xué)特征、臨床癥狀、剖解病變及病原菌的鑒定，最終確診為雞大腸桿菌病。

1.2.2 復(fù)方中藥藥液的制備 取上述復(fù)方中藥粉劑40.0 g，采用傳統(tǒng)煎煮方法煎煮20 min，用無菌紗布過濾后將藥液濃縮至40.0 mL，此時(shí)藥液濃度為1.0g/mL。將該藥液稀釋，最后得到0.25g/mL、0.5 g/mL、1.0 g/mL 復(fù)方中藥藥液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.3 氟苯尼考藥液制備 以100 g 藥對150 kg 滅菌水的比例配制，即得0.2 mg/mL 氟苯尼考藥液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.2.4 被分離大腸桿菌藥敏試驗(yàn) 根據(jù)李心海等[8]使用的方法測定大腸桿菌對上述藥物的敏感性。用直徑為6 mm 的打孔器將定性濾紙制作成若干小圓片，高壓滅菌后將其分成4 份，1 份滅菌濾紙片用0.2 mg/mL 氟苯尼考藥液浸泡5 min，使每個(gè)紙片含藥量為30 μg，其余3 份滅菌濾紙片分別用0.25、0.5、1.0 g/mL 相同體積的復(fù)方中藥藥液浸泡5 min，取出放入滅菌培養(yǎng)皿中干燥。使用涂布棒將菌液（1.5×108cfu/ml）均勻地涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，將標(biāo)記好的4 種藥敏片貼于培養(yǎng)基上，每種藥物重復(fù)放3 個(gè)，重復(fù)4 個(gè)培養(yǎng)皿。37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，測定每個(gè)藥敏片的抑菌圈直徑，并計(jì)算平均直徑。

1.2.5 復(fù)方中藥對雞大腸桿菌病臨床療效 將文水某雞場被確診為雞大腸桿菌病的830 羽病雞隨機(jī)分為5 組，對照組（30 羽雞，不予治療），其余分成4 組，每組200 羽雞，分別用0.25、0.5、1.0 g/mL 復(fù)方中藥藥液，0.2 mg/mL 氟苯尼考藥液進(jìn)行飲水治療，治療3 d，統(tǒng)計(jì)治愈率、好轉(zhuǎn)率、無效率及死亡率。

1.2.6 雞紅細(xì)胞C3bR 花環(huán)率、免疫復(fù)合物（IC）花環(huán)率的測定[9]根據(jù)文獻(xiàn)[10]制備酵母菌與紅細(xì)胞的菌懸液，將C3b 致敏酵母菌懸液和經(jīng)藥物治療后的雞紅細(xì)胞懸液混勻，37 ℃水浴40 min，經(jīng)戊二醛固定、涂片、干燥、甲醇固定后染色鏡檢，計(jì)算C3bR花環(huán)率。IC 花環(huán)率測定中所用酵母菌懸液不致敏，其余操作同C3bR 花環(huán)率試驗(yàn)。

1.2.7 復(fù)方中藥安全性試驗(yàn)

1.2.7.1 急性毒性試驗(yàn) 取6 g 復(fù)方中藥樣品研細(xì)，過120 目篩后用蒸餾水稀釋成20 mL 混懸液，藥物質(zhì)量濃度為0.3 g/mL。選用18～22 g小鼠20 只，隨機(jī)分為2 組，雌雄各半。大部分中藥及其制劑毒性較小，常難以準(zhǔn)確測出其LD50，因此，常用最大給藥量來測定試驗(yàn)動物對中藥的耐受量[11-12]。按最大給藥量20 mL/kg，計(jì)算出本研究中藥給藥劑量為6 000 mg/kg，經(jīng)口灌胃給藥，對照組予以等量生理鹽水。觀察動物的一般狀況、中毒癥狀和死亡情況，觀察期為14 d[13]。

1.2.7.2 小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn) 根據(jù)張林等[14]提供的方法，將50 只KM 小鼠隨機(jī)分為5 組，雌雄各半。按3 個(gè)劑量組（當(dāng)受試藥物L(fēng)D50＞5 000 mg/kg 時(shí)，5 000 mg/kg 設(shè)為高劑量組，2 500、1 250 mg/kg 設(shè)為中、低劑量組）和2 個(gè)對照組（陰性對照為蒸餾水，陽性對照為環(huán)磷酰胺50 mg/kg）進(jìn)行試驗(yàn)，計(jì)算微核率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行處理，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）表示，比較各組的差異顯著性，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥與氟苯尼考對大腸桿菌的抑制作用

由表1 可知，氟苯尼考的抑菌圈直徑顯著高于復(fù)方中藥組（P＜0.05），表明氟苯尼考的體外抑菌能力強(qiáng)于復(fù)方中藥；復(fù)方中藥對被分離的大腸桿菌也具有一定的抑菌能力，且這種能力與質(zhì)量濃度大小有關(guān)，0.5、1.0 g/mL 復(fù)方中藥組間抑菌圈直徑無顯著差異（P＞0.05），且兩者顯著高于0.25 g/mL 復(fù)方中藥組（P＜0.05），表明0.5、1.0 g/mL 復(fù)方中藥對大腸桿菌抑菌能力相當(dāng)，且顯著高于0.25 g/mL 復(fù)方中藥。

表1 復(fù)方中藥及氟苯尼考對被分離大腸桿菌的抑菌結(jié)果

2.2 復(fù)方中藥與氟苯尼考對雞大腸桿菌病的療效

從表2 可以看出，與不予治療組相比，使用藥物治療后，患病雞無效率與死亡率均明顯降低，0.25 g/mL 復(fù)方中藥組患病雞的治愈率與好轉(zhuǎn)率最低，0.5、1.0 g/mL 復(fù)方中藥組療效優(yōu)于0.25 g/mL 復(fù)方中藥組，且明顯優(yōu)于氟苯尼考組的治療效果。

表2 復(fù)方中藥與氟苯尼考對雞大腸桿菌病的療效 %

2.3 復(fù)方中藥與氟苯尼考對感染大腸桿菌病雞紅細(xì)胞免疫指標(biāo)的影響

由表3 可知，經(jīng)藥物治療3 d 后，患病雞紅細(xì)胞C3bR 花環(huán)率顯著增高，其中，經(jīng)0.5、1.0 g/mL 復(fù)方中藥組治療后雞紅細(xì)胞C3bR 花環(huán)率顯著高于其他組（P＜0.05）；而經(jīng)藥物治療3 d 后，患病雞紅細(xì)胞IC 花環(huán)率無顯著變化（P＞0.05）。

表3 復(fù)方中藥與氟苯尼考對感染大腸桿菌病雞紅細(xì)胞免疫指標(biāo)的影響 %

2.4 復(fù)方中藥的安全性試驗(yàn)

2.4.1 復(fù)方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響 復(fù)方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的影響如表4 所示。

表4 復(fù)方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE）微核率的影響

微核率反映了細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的損傷程度。從表4 可知，環(huán)磷酰胺陽性對照組微核率顯著升高，說明本試驗(yàn)結(jié)果可靠。各劑量復(fù)方中藥組之間無顯著差異（P＞0.05），且均與陰性組無顯著差異（P＞0.05），表明各劑量復(fù)方中藥未對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞遺傳物質(zhì)造成損傷。

2.4.2 復(fù)方中藥對小鼠的急性毒性 經(jīng)胃染毒后，小白鼠無不良反應(yīng)和死亡情況。根據(jù)急性毒性劑量分級標(biāo)準(zhǔn)，小鼠經(jīng)口攝入復(fù)方中藥后LD50＞5000mg/kg，屬實(shí)際無毒物質(zhì)[15]。

3 結(jié)論與討論

本研究選用扶正固本、清熱解毒的一種復(fù)方中藥對文水某雞場的大腸桿菌病雞進(jìn)行治療，并以氟苯尼考作為對照組，結(jié)果表明，0.5、1.0 g/mL 劑量的復(fù)方中藥對患病雞具有較高的治愈率，效果優(yōu)于氟苯尼考。屈倩等[16]使用中藥復(fù)方加味穿心蓮散治療35 周齡大腸桿菌病雞，顯著降低了雞的死亡率（11.67%），但仍大于本研究中0.5、1.0 g/mL 復(fù)方中藥組死亡率（均為2.0%）。在體外抑菌試驗(yàn)中，0.5、1.0 g/mL 復(fù)方中藥組雖對分離的大腸桿菌具有一定的抑制作用，但其抑菌作用顯著低于氟苯尼考組，可推測復(fù)方中藥療效優(yōu)于氟苯尼考的原因不在于其抑菌作用。

近年來，研究者對穿心蓮、白扁豆等做了很多研究，證明其具有抗炎、抑菌、調(diào)節(jié)免疫等作用，尤其在調(diào)節(jié)免疫方面，在現(xiàn)代臨床上具有廣泛應(yīng)用[17-18]。反映紅細(xì)胞膜上空位C3bR 多少的指標(biāo)—紅細(xì)胞C3bR 花環(huán)率的高低可反映紅細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱，而紅細(xì)胞免疫功能的強(qiáng)弱又會影響白細(xì)胞的免疫功能。因此，紅細(xì)胞膜上的受體是機(jī)體免疫的基礎(chǔ)。本研究表明，各組紅細(xì)胞IC 花環(huán)率差異并不顯著，但復(fù)方中藥組與對照組相比，紅細(xì)胞C3bR 花環(huán)率顯著升高，且隨著藥物劑量增加而升高。這一結(jié)果顯示，本試驗(yàn)所用復(fù)方中藥可增強(qiáng)感染大腸桿菌病雞紅細(xì)胞免疫功能，且與用藥劑量有關(guān)，0.5 g/mL的用藥劑量既經(jīng)濟(jì)，治療效果又最佳。艾軍[19]用固本方治療大腸桿菌病雞，研究發(fā)現(xiàn)，中藥能顯著增強(qiáng)雞紅細(xì)胞C3bR 花環(huán)率，與本試驗(yàn)結(jié)果相吻合。分析該復(fù)方中藥的藥效機(jī)理可能是：一方面抑制病原菌在雞體內(nèi)繁殖，更重要的是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，提高機(jī)體自身的抗病力，從而達(dá)到治療的目的。

由于中藥成分的復(fù)雜性，其化學(xué)組成研究相對薄弱，在臨床應(yīng)用時(shí)必須考慮到其安全性。本研究對復(fù)方中藥進(jìn)行了急性毒性與遺傳毒性試驗(yàn)，該復(fù)方中藥對小鼠經(jīng)口攝入LD50＞5 000 mg/kg，故可以證實(shí)其屬實(shí)際無毒物質(zhì)。微核是骨髓內(nèi)未成熟紅細(xì)胞受環(huán)磷酰胺等化學(xué)誘變劑作用而發(fā)生的一種表現(xiàn)，微核率的高低反映了細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的受損程度[20]。本研究中的復(fù)方中藥對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞無致微核作用，即對機(jī)體的遺傳物質(zhì)無損傷作用，說明其無遺傳毒性。夏勇等[21]研究發(fā)現(xiàn)，高劑量的某復(fù)方中藥制劑對大鼠有肝、腎毒性，說明中藥對動物機(jī)體存在一定的毒性，因此，還需對本試驗(yàn)復(fù)方中藥的重金屬、砷等有害物質(zhì)含量以及亞急性毒性做進(jìn)一步研究。