魏榮省,李旭嬌,李會會,李心怡,韓守暖,朱兵峰

(1.魯南制藥集團股份有限公司,山東 臨沂 273400;2.魯南新時代生物技術有限公司,山東 臨沂 273400;3.哺乳動物細胞高效表達國家工程實驗室,山東 臨沂 273400)

紐莫康定(Pneumocandins)是由Zalerionarboricola[1-5]產生的一類天然抗真菌藥物,對多種念珠菌、地方性真菌、曲霉及卡氏肺囊蟲均有效,受到人們的廣泛關注。其主要作用機理是能夠非競爭性的抑制真菌細胞壁中β-1,3-葡聚糖合成酶的活性,引起細胞壁裂解以及細胞內外滲透壓的改變,從而將真菌細胞殺死。按照其結構中脯氨酸上取代基的不同主要分為紐莫康定A0(3-羥基-4-甲基脯氨酸)、紐莫康定B0(3-羥基脯氨酸)和紐莫康定C0(4-羥基脯氨酸)3大類[6],其中紐莫康定B0脫側鏈后的環(huán)狀六肽母核是合成棘白菌素類藥物醋酸卡泊芬凈[7](Caspofungin acetate)的中間體。醋酸卡泊芬凈由默克公司原研,屬廣譜抗真菌藥物,對包括曲霉和念珠菌屬在內的真菌均有良好的抗菌作用。紐莫康定B0與紐莫康定C0屬于同分異構體,兩者的差別僅在于脯氨酸殘基上的一個羥基的位置不同,在通常條件下很難實現分離,而紐莫康定C0為紐莫康定B0生產過程中的關鍵雜質,會通過合成路線逐步傳遞到終產品醋酸卡泊芬凈原料藥中,并生成非藥效成分類卡泊芬凈,影響產品質量。目前,各國藥典雖然還未收錄紐莫康定和醋酸卡泊芬凈相關質量標準,但是各生產廠家均已將紐莫康定C0列入質量標準加以控制。因此,開發(fā)一種能同時準確檢測紐莫康定B0和紐莫康定C0質量濃度的方法對于控制紐莫康定乃至醋酸卡泊芬凈的產品質量非常重要。

反相HPLC法[8-10]測定紐莫康定B0的文獻報道雖然較多,但此類方法只能實現紐莫康定A0的分離,紐莫康定B0和紐莫康定C0峰完全重疊;通過正相HPLC法,雖然能夠實現紐莫康定B0和紐莫康定C0的同時檢測,但使用的二氯甲烷、乙酸乙酯等試劑毒性較大,雜質檢出少且峰響應值偏低。親水作用色譜法HILIC模式[11]為新興的色譜技術,使用兩性離子填料[12]能夠同時檢測紐莫康定B0和紐莫康定C0,但此填料柱效差,鍵合相流失快,色譜柱壽命短,且要求使用等度洗脫,殘留雜質可能會影響下一樣品的檢測;使用氨基填料不能分離紐莫康定B0和紐莫康定C0;使用聚合多氨填料能夠同時檢測紐莫康定B0和紐莫康定C0,但柱壽命只比氨基柱延長50%左右,同樣壽命短。筆者使用三鍵鍵合酰胺填料,建立了HILIC模式的梯度方法,既能同時快速準確測定紐莫康定B0和紐莫康定C0,又大大延長柱壽命,也解決了樣品批處理的殘留問題,為有效控制紐莫康定生產質量提供了一條有效途徑。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(VWD-DAD)、Agilent 1290 2DLC-6540B QTOF LC-MS、Thermo Evolution 3000紫外分光光度計、METTLER TOLEDO XS105DU分析天平、METTLER TOLEDO MS 205 DU分析天平。

1.2 材 料

紐莫康定B0對照品(質量分數95.56%,批號16001,大同市礦區(qū)風華生物科技有限公司),紐莫康定C0對照品(質量分數95.11%,批號16002,大同市礦區(qū)風華生物科技有限公司);紐莫康定B0發(fā)酵液(F 301180301 F,自制),紐莫康定B0粗品(F 301170401 Ⅰ,自制),紐莫康定B0凍干粉(F 301180501 K,自制);乙腈、甲醇和乙醇均為色譜純,鹽酸、雙氧水和氫氧化鈉均為分析純,水為純化水。

2 方法與結果

發(fā)酵過程中會產生一系列紐莫康定類似物,其中3個主要紐莫康定結構類似物結構式為

本方法主要是針對其中同分異構體紐莫康定B0和C0進行的研究。

2.1 色譜條件

色譜柱Waters XBridge?Amide柱(4.6 mm×250 mm,3.5 μm),檢測波長220 nm,流速1 mL/min,柱溫40 ℃,進樣量10 μL;流動相為V(A)∶V(B)(其中:A為純水;B為乙腈),梯度洗脫(0～10 min,B 93%～84%;10～18 min,B 84%;18～19 min,B 84%～50%;19～28 min,B 50%;28～29 min,B 50%～93%;29～35 min,B 93%)。

2.2 溶液配制

2.2.1 紐莫康定B0對照品溶液

取紐莫康定B0對照品約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超聲溶解后,稀釋至刻度,搖勻,制得質量濃度為400 mg/L的紐莫康定B0對照品溶液。

2.2.2 紐莫康定C0對照品溶液

取紐莫康定C0對照品約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超聲溶解后,稀釋至刻度,搖勻;精密量取上述溶液1 mL,置于10 mL容量瓶中,用乙醇稀釋至刻度,搖勻,制得質量濃度為40 mg/L的紐莫康定C0對照品溶液。

2.2.3 紐莫康定B0發(fā)酵液

準確量取紐莫康定發(fā)酵液20 mL,加乙醇80 mL,勻漿10 min,過濾,取濾液適量離心(4 000 r/min)10 min,取上清液,用0.45 μm濾膜過濾,即得。

2.2.4 紐莫康定B0粗品溶液

取粗品約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,加乙醇超聲溶解后,稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.2.5 紐莫康定B0凍干粉溶液

取紐莫康定B0凍干粉約20 mg,精密稱定,置于50 mL容量瓶中,用乙醇超聲后,稀釋至刻度,搖勻,即得。

2.3 色譜條件的選擇

2.3.1 波長的確定

實驗分別采用紫外分光光度計和二極管陣列檢測器對紐莫康定B0對照品溶液、紐莫康定C0對照品溶液分別進行UV全波長掃描,掃描紐莫康定B0乙醇溶液UV光譜圖如圖1所示。結果顯示:在乙醇溶液中紐莫康定B0的UV吸收和紐莫康定C0的UV吸收光譜圖完全一致,在波長220 nm處可以看到有較強吸收,且響應相對平緩,波長耐用性較好。因此,筆者選用220 nm作為紐莫康定B0和紐莫康定C0質量濃度的檢測波長。

圖1 紐莫康定B0乙醇溶液UV光譜圖

2.3.2 梯度洗脫優(yōu)化

與甲醇水體系相比,乙腈水體系各雜質檢出個數和峰形均較好,故選用乙腈水體系進行優(yōu)化。首先通過等度洗脫方法摸索,V(純水)∶V(乙腈)=8∶92為紐莫康定B0、紐莫康定C0洗脫的臨界比例。為增加樣品洗脫效果,保證紐莫康定B0、紐莫康定C0與前后雜的基線分離,選擇V(純水)∶V(乙腈)=7∶93為梯度洗脫初始比例,V(純水)∶V(乙腈)=16∶84為主峰洗脫比例。由于樣品中殘留雜質會影響下一針樣品的準確度,經不同梯度摸索,得出V(純水)∶V(乙腈)=50∶50能夠對樣品的雜質進行完全洗脫,所以選用V(純水)∶V(乙腈)=50∶50進行雜質洗脫,為保證批處理樣品時,連續(xù)進樣系統(tǒng)的穩(wěn)定性,增加V(純水)∶V(乙腈)=7∶93系統(tǒng)平衡,用時6 min。

2.4 LC-MS鑒定

取紐莫康定B0粗品溶液,按照2.1項中色譜條件采用分流法進行LC-MS分析,其結果如圖2所示,紐莫康定B0和紐莫康定C0保留時間分別為9.04 min和10.16 min,m/z均為1 064[13-14]。

圖2 LC-MS圖

2.5 分析方法驗證

筆者對本方法耐用性、系統(tǒng)適用性、專屬性、線性、檢測限、定量限、準確度、重復性和溶液穩(wěn)定性進行了相應驗證,具體驗證結果匯總如表1所示。

表1 方法驗證結果匯總

2.5.1 耐用性試驗

通過改變流速(0.8,1.2 mL/min)、柱溫(35,45 ℃)、進樣量(5,15 μL)、色譜柱(Waters XBridge?Amide柱其他批次和月旭Ultimate?HILIC Amide柱),考察方法耐用性。經試驗,以上色譜條件變化均能滿足最新版中國藥典對系統(tǒng)適用性試驗的要求,提示該方法耐用性良好。

2.5.2 系統(tǒng)適用性試驗

取粗品溶液,按照2.1項中色譜條件進行測定,連續(xù)進樣6針,記錄色譜圖如圖3所示。結果顯示:紐莫康定B0色譜峰的保留時間與峰面積的RSD均小于0.5%,理論塔板數大于90 000;紐莫康定C0色譜峰的保留時間與峰面積的RSD均小于0.5%,理論塔板數大于80 000,紐莫康定B0與紐莫康定C0色譜峰分離度大于2.4。

圖3 典型色譜圖

2.5.3 專屬性試驗

稀釋劑色譜乙醇對紐莫康定B0和紐莫康定C0檢測無干擾,溶解性良好,進樣量30 μL以內無溶劑效應。液相DAD檢測器顯示紐莫康定B0和紐莫康定C0峰純度因子均大于990。破壞試驗測定結果如表2所示。

表2 破壞試驗結果

破壞出的雜質對紐莫康定B0檢測有干擾,對紐莫康定C0檢測無干擾,主要降解雜質經LC-MS鑒定,m/z為1 064。

對品種最大單雜B0絲氨酸同系物進行定位,發(fā)現B0絲氨酸同系物與紐莫康定B0保留時間一致。

2.5.4 線性試驗

分別精密量取紐莫康定B0和紐莫康定C0對照品溶液1,2,4,6,8,10 mL,置于6個10 mL容量瓶中,加乙醇稀釋至刻度,定容,搖勻,制成6個不同質量濃度的線性溶液[15-16],加定量限溶液共7個點,按照2.1項中色譜條件,分別進樣,記錄色譜圖。以對照品溶液中各組分質量濃度C為橫坐標,色譜峰面積A為縱坐標,進行紐莫康定B0和紐莫康定C0的線性回歸,得線性方程分別為

AB0=2.614 2C-8.392 2,r=0.999 2

AC0=2.510 3C-7.464 7,r=0.999 5

2.5.5 定量限、檢測限試驗

分別將紐莫康定B0和紐莫康定C0對照品溶液逐步稀釋,按照2.1項中色譜條件進樣測定,以信噪比約等于3的質量濃度為各組分的檢測限,信噪比約等于10的質量濃度為各組分的定量限。測定結果如表3所示。

表3 定量限和檢測限

2.5.6 準確度試驗

各取紐莫康定B0對照品溶液和發(fā)酵液上清液0.5 mL混合(相當于100%水平的質量濃度400 mg/L)6份樣品作為紐莫康定B0加標回收率供試品溶液[17],另各取紐莫康定C0對照品溶液和發(fā)酵液上清液0.5 mL混合(相當于100%水平的質量濃度40 mg/L)6份樣品作為紐莫康定C0加標回收率供試品溶液,按照2.1項中色譜條件分別進樣測定,按外標法以峰面積計算紐莫康定B0和紐莫康定C0的回收率。結果可得:紐莫康定B0和紐莫康定C0的平均回收率分別為99.2%,98.9%;相對標準偏差RSD分別為1.68%,1.71%。

2.5.7 重復性試驗

精密稱定粗品6份,按照2.2項中溶液配制方法配制供試品溶液,按照2.1項中色譜條件進樣測定,按外標法以峰面積計算6份供試品中紐莫康定B0和紐莫康定C0質量濃度,計算紐莫康定B0和紐莫康定C0質量濃度的相對標準偏差RSD分別為0.39%,0.42%。

2.5.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取紐莫康定B0對照品溶液、紐莫康定C0對照品溶液、發(fā)酵液、粗品溶液和紐莫康定B0凍干粉溶液,室溫放置,于0,2,4,8,12,24 h分別進樣測定,計算得紐莫康定B0對照品溶液主峰面積的RSD為0.75%,紐莫康定C0對照品溶液主峰面積的RSD為0.81%,發(fā)酵液中紐莫康定B0和紐莫康定C0峰面積的RSD分別為1.39%和1.44%,粗品溶液中紐莫康定B0和紐莫康定C0峰面積的RSD分別為1.27%和1.36%,紐莫康定B0凍干粉溶液峰面積的RSD為0.77%。結果表明對照品溶液和供試品溶液在室溫條件下24 h內穩(wěn)定。

3 結 論

雜質研究及控制是藥品質量保證的關鍵因素,而異構體的控制是產品質量控制的難點。本實驗同時檢測紐莫康定樣品中同分異構體紐莫康定B0和紐莫康定C0質量濃度的HPLC方法,并分別檢測了紐莫康定發(fā)酵液、粗品和凍干粉。結果表明:樣品中紐莫康定B0和紐莫康定C0的分離度、重復性和穩(wěn)定性良好。此方法具有操作簡單、穩(wěn)定性強、靈敏度高和耐用性好等特點,為有效控制紐莫康定產品質量提供了保障。