索光喜，胡倘瀟，肖天保

（貴州中醫(yī)藥大學研究生院，貴陽 550000）

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）為累及回腸、直腸、結(jié)腸的一種特發(fā)性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。╟rohn disease，CD）〔1〕，兩者主要癥狀均為腹痛、腹瀉，或有便血，目前發(fā)病原因及機制尚不明確。西醫(yī)藥物治療主要以控制腸道炎癥為目的，雖然療效肯定，但需要長期維持治療，且容易反復發(fā)作。炎癥性腸病屬于中醫(yī)“泄瀉”范疇，中醫(yī)經(jīng)典方劑“痛瀉要方”已廣泛用于治療炎癥性腸病，諸多臨床研究顯示其療效顯著〔2〕，有實驗研究顯示痛瀉要方可能是通過提高腸道組織的抗氧化能力、調(diào)節(jié)免疫功能以及調(diào)節(jié)腸道血流、促進潰瘍愈合等發(fā)揮作用〔3-5〕。但受制于實驗條件限制，目前針對中藥治療機制的研究多處于觀察層面，在現(xiàn)有研究中，各方面機制研究較為單一，缺乏整體性認識。隨著現(xiàn)代生物化學對中藥成分及作用靶點研究的不斷完善，根據(jù)相關(guān)作用靶點來系統(tǒng)預測其作用機制成為可能。因此，基于現(xiàn)有的大量研究數(shù)據(jù)，通過網(wǎng)絡藥理技術(shù)預測痛瀉要方治療炎癥性腸病的作用機制，為臨床試驗及新藥研發(fā)提供參考。

1 方法及結(jié)果

1.1 痛瀉要方中相關(guān)成分的查詢及篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）檢索痛瀉要方中四味中藥（陳皮、白芍、白術(shù)、防風）的化學成分，以通用參考指標口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件，篩選各味中藥的有效化學成分，并查詢對應的靶點信息。建立藥物成分及作用靶點的數(shù)據(jù)庫。剔除重復成分及靶點，共篩選出有效藥物成分39 個，其中32 個成分有明確的靶點數(shù)據(jù)，共涉及125個靶點。見表1。

表1 痛瀉要方中藥物化學成分及靶點情況

1.2 炎癥性腸病相關(guān)靶點的收集在GeneCards（www.genecards.org）及OMIM（omim.org）數(shù)據(jù)庫以“inflammatory bowel disease”為搜索詞搜索與炎癥性腸病相關(guān)的疾病靶點，建立疾病靶點數(shù)據(jù)庫。合并后剔除重復靶點，共有5 852 個疾病靶點。

1.3 篩選共有靶點利用R 語言，篩選出藥物靶點（125 個）與疾病靶點（5 852 個）的共有靶點（104個），并保存相關(guān)共有靶點數(shù)據(jù)。

1.4 藥物成分治療網(wǎng)絡可視化利用R 語言過濾出與共有靶點相關(guān)的藥物成分，并建立“藥物成分-疾病靶點”數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)庫文件導入Cytoscape軟件構(gòu)建“藥物成分-疾病靶點”網(wǎng)絡，探究“藥物成分-疾病靶點”之間的相關(guān)性。見圖1。痛瀉要方中有31 個化學成分可通過作用于炎癥性腸病的104個靶點而發(fā)揮治療作用。

圖1 “藥物成分-疾病靶點”網(wǎng)絡

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡（PPI），篩選核心靶點將“藥物成分-疾病靶點”數(shù)據(jù)庫文件中的靶點信息導入STRING（string-db.org）網(wǎng)站，構(gòu)建PPI，根據(jù)靶點蛋白之間相互作用的度值大小篩選出核心靶點。見圖2。

圖2 “藥物成分-疾病靶點”PPI與連接節(jié)點條形圖

圖2 中蛋白靶點的連接節(jié)點數(shù)越多，表示其在生物過程中發(fā)揮的作用越大，根據(jù)結(jié)果顯示，“藥物成分-疾病靶點”核心蛋白按度值由高至低依次 為：IL6、AKT1、MAPK3、JUN、CASP3、MAPK1、PTGS2、MAPK8、ESR1、HSP90AA1、CAT、CCND1、MMP9、PPARG、MAPK14、CREB1、RELA、AR、CCL2、HMOX1、AHR。由此推斷，痛瀉要方中的化學成分，可能主要通過影響以上蛋白的表達來干預炎癥性腸病的治療。

1.6 GO 功能分析所謂GO 功能分析是對所有已知基因進行功能分類，通過R 語言，利用bioconductor 上dose 程序?qū)?04 個“藥物-疾病”共有靶點進行GO 功能分析。見表2。痛瀉要方作用于炎癥性腸病靶點的基因功能主要集中在氨基結(jié)合（amide binding：13 個基因）、核受體活性（nuclear receptor activity：11個基因）、轉(zhuǎn)錄因子活性（transcription factor activity：11 個基因）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding：11 個基因）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity：10 個基因）等生物表達功能上。

1.7 KEGG 通路富集分析KEGG 通路是目前人類已知的存在于生物體內(nèi)的生物信號通路過程，將篩選到的“藥物-疾病”共有靶點富集在目前已知的信號通路上，可以進一步了解相關(guān)藥物成分對生物信號通路的影響。通過R 語言，利用bioconductor 上clusterprofile 程序?qū)ⅰ八幬?疾病”共有靶點進行KEGG 通路富集，得到20 條通路富集結(jié)果，結(jié)果顯示，前10 條KEGG 通路主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、IL-17（白細胞介素-17）信號通路、Toll樣受體信號通路等。見表3。

表2 “藥物-疾病”共同靶點GO功能分析結(jié)果

表3 “藥物-疾病”共同靶點KEGG通路富集結(jié)果

2 討論

目前炎癥性腸病發(fā)病機制仍不明確，西藥治療主要以控制腸道炎癥為主，主要包括氨基水楊酸類、激素類和免疫抑制劑3 大類〔6〕。雖然療效確切，但需要長期用藥，且產(chǎn)生的副作用較大。中藥痛瀉要方出自《丹溪心法》，常用于治療脾虛肝旺所致的腸鳴腹痛、大便泄瀉，療效確切。大量現(xiàn)代研究表明，痛瀉要方可以減輕腸道黏膜的炎癥反應，促進腸道黏膜潰瘍的愈合〔7〕。但中醫(yī)藥作用機制復雜，目前針對痛瀉要方治療炎癥性腸病的機制研究多具有一定的片面性，故結(jié)合目前最前沿的現(xiàn)代醫(yī)學研究成果，從整體角度探討其作用機制，具有積極意義。

根據(jù)本研究結(jié)果分析推測：痛瀉要方4 味中藥中共有31種治療炎癥性腸病的主要活性成分，目前研究表明白芍中的β-谷甾醇能顯著抑制結(jié)腸縮短，降低結(jié)腸炎的嚴重程度，顯著降低炎癥因子IL-1（白細胞介素-1）、IL-6（白細胞介素-6）、MCP-1（單核細胞趨化蛋白-1）和相關(guān)COX-2（環(huán)氧合酶-2）的水平〔8〕。芍藥苷可以抑制腸系膜和結(jié)腸組織中巨噬細胞的浸潤，抑制結(jié)腸巨噬細胞中NLRP3蛋白并抑制細胞因子IL-1β 的釋放〔9〕。陳皮中的柚皮素能阻斷NF-κB 信號通路，減少腸道中產(chǎn)生的氧自由基，修復損傷的組織〔10〕。

在UC 結(jié)腸細胞水平研究上，痛瀉要方中相關(guān)成分通過影響IL6、AKT1、MAPK3、JUN、CASP3、MAPK1、PTGS2、MAPK8、ESR1、HSP90AA1、CAT、CCND1、MMP9、PPARG、MAPK14、CREB1、RELA、AR、CCL2、HMOX1、AHR 的表達來治療炎癥性腸病，相關(guān)研究表明IL-6的表達可引起機體產(chǎn)生炎癥反應〔11-12〕。AKT 蛋白表達增強，激活NF-κB 等核轉(zhuǎn)錄因子，促使產(chǎn)生大量的促炎性細胞因子，誘導或持續(xù)炎癥，另一方面刺激細胞持續(xù)生長，抑制細胞凋亡，增加癌變機會〔13〕。MAPK 蛋白及mRNA 在UC中表達均有顯著升高（P＜0.01），提示炎癥因子大量產(chǎn)生，從而形成腸道炎癥表現(xiàn)〔14〕。重癥UC 患者血清NLRP3、CASP1 和NF-κB mRNA 表達水平均顯著升高，且NLRP3 mRNA 與CASP1、NF-κB mRNA 表達呈正相關(guān)〔15〕。

GO 功能分析結(jié)果顯示，痛瀉要方中治療炎癥性腸病的104個靶點基因的富集生物學功能主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表達以及藥物反應等過程，反映出痛瀉要方作用于細胞的生物過程也是多樣化的。KEGG 通路富集分析表明，痛瀉要方治療炎癥性腸病的靶點通路主要涉及腫瘤壞死因子信號通路、IL-17信號通路，Toll樣受體等途徑。眾多研究表明TNF-α（腫瘤壞死因子-α）是重要的炎癥啟動因子，主要由單核巨噬細胞產(chǎn)生，通過表達凝血因子、成纖維增殖因子和黏附因子以及啟動細胞急性反應、凋亡等過程發(fā)揮作用〔16〕。而IL-17則可能是通過促進白細胞釋放過量的化學因子引起組織炎癥的發(fā)生，最終強化了腸道內(nèi)的炎性反應而導致炎癥性腸病的形成〔17〕。Toll 樣受體（TLRs）∕NF-κB 信號傳導通路參與了UC 發(fā)病機制，在調(diào)節(jié)涉及黏膜炎癥反應中起核心作用〔18〕?，F(xiàn)代研究認為p53信號通路多與癌變相關(guān)，提示痛瀉要方可能通過影響p53 信號通路抑制UC 癌變。此外KEGG 結(jié)果顯示痛瀉要方還可以通過影響乙肝感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE受體信號通路、丙肝感染等通路治療炎癥性腸病，這些信號通路在炎癥性腸病的臨床研究中少被提及，或許可以成為新的研究方向。

綜上，在相關(guān)文獻研究的基礎上結(jié)合網(wǎng)絡藥理學分析，可推測痛瀉要方是通過調(diào)節(jié)炎癥通路及干預炎癥的發(fā)展過程來發(fā)揮抗炎癥性腸病的作用。本研究為探索痛瀉要方的作用機制提供了新的方法和思路，也為下一步實驗研究以及有效藥物成分的開發(fā)提供一些參考。