唐玉蓮，陳啟威2，韋貴將2，李玉穎，候沅林，盧詩麗，劉潔蘭，王太重

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000)

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是我國南部及東南亞地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤，因其起病隱匿、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早、惡性程度高等，患者生存率一直較低[1]。血小板衍生生長因子(platelet-derived growth factor subunit，PDGF)是體內(nèi)一種重要的促細(xì)胞生長和誘導(dǎo)分化因子，近幾年研究發(fā)現(xiàn)其與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其在腫瘤細(xì)胞黏附、遷移、血管生成和浸潤轉(zhuǎn)移中起重要作用[2]。PDGF家族包含許多成員，而PDGFA是PDGF家族成員的一種，以二聚體形式存在。PDGFA與膜上相應(yīng)受體——PDGF受體(PDGFreceptor，PDGFR)結(jié)合后可促使受體分子形成二聚體，激活細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，酪氨酸殘基磷酸化，從而將胞外信號傳入胞內(nèi)，經(jīng)級聯(lián)放大效應(yīng)調(diào)控細(xì)胞的分裂和增生。多項(xiàng)研究表明[3-7]，PDGFA基因與多種腫瘤密切相關(guān)。PDGFA基因的過表達(dá)能夠促進(jìn)諸如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的自我更新和結(jié)直腸癌中的血管生成和肝轉(zhuǎn)移。PDGFA基因還可能通過PDGF/AKT信號通路促進(jìn)乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展，或誘導(dǎo)間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞對頭頸部鱗癌腫瘤微環(huán)境的趨化作用等。故PDGFA有望成為這些腫瘤基因診斷和治療的有效靶點(diǎn)。但是，目前關(guān)于PDGFA基因在鼻咽癌中的表達(dá)及作用較少見報(bào)道。 本文擬通過基因芯片數(shù)據(jù)分析PDGFA基因在鼻咽癌中的差異表達(dá)，并探索其詳細(xì)功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為更深入理解鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制、篩查發(fā)現(xiàn)易感基因和潛在基因治療靶點(diǎn)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 從美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)的GEO數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)中檢索鼻咽癌組織基因芯片表達(dá)譜。通過GEODataSets檢索模式檢索出符合條件的基因芯片數(shù)據(jù)集(GSE13597)，該數(shù)據(jù)集包含3個(gè)正常鼻咽黏膜組織樣本和25個(gè)鼻咽癌組織樣本。

1.2 方法

1.2.1 差異表達(dá)基因篩選 利用GEO數(shù)據(jù)庫中的GEO2R在線分析工具，對系列數(shù)據(jù)(series)進(jìn)行分析，以差異表達(dá)基因上調(diào)倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)的絕對值，即∣FC∣>2，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出差異表達(dá)基因。查找PDGFA基因在鼻咽癌組織中的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，下載并進(jìn)行差異顯著性分析。

1.2.2PDGFA及其相關(guān)基因的功能富集分析 使用STRING在線數(shù)據(jù)庫(https：//string-db.org/)檢索與PDGFA基因其編碼蛋白存在互作關(guān)系的蛋白，篩選出PDGFA相關(guān)基因。經(jīng)DAVID在線數(shù)據(jù)庫(https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp)對PDGFA及相關(guān)基因進(jìn)行功能富集分析，以FDR<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3PDGFA參與的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析以及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測 根據(jù)PDGFA基因在數(shù)據(jù)庫中的注釋情況，使用GCBI在線實(shí)驗(yàn)室(https：//www.gcbi.com.cn/gclib/html/index)對PDGFA基因與其他基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 差異表達(dá)基因篩選，采用SPSS 14.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1PDGFA基因在鼻咽癌組織中的表達(dá) GSE13597基因芯片數(shù)據(jù)集中，共篩選出包含PDGFA基因在內(nèi)的790個(gè)基因，其中449個(gè)上調(diào)、341個(gè)下調(diào)(見圖1)。PDGFA基因在鼻咽癌組織樣本中高表達(dá)，其在4個(gè)正常鼻咽黏膜組織樣本和14個(gè)鼻咽癌組織樣本中的表達(dá)量情況見圖2，其在兩樣本間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見圖3)。

注：藍(lán)色為顯著下調(diào)表達(dá)基因，紅色為顯著上調(diào)表達(dá)基因。

注：圖中柱形高度為PDGFA基因在各樣本中的相對表達(dá)量。

注：橫坐標(biāo)為樣本分組，縱坐標(biāo)為PDGFA的相對表達(dá)量值。

2.2PDGFA及其相關(guān)基因的功能富集分析 經(jīng)STRING在線數(shù)據(jù)庫檢索，共檢索出20個(gè)與PDGFA基因其編碼蛋白存在緊密互作關(guān)系的蛋白(見圖4)。它們分別是PLCG1、KRAS、PDGFRA、PDGFRB、PIK3CA、EGFR、PDGFB、CD247、HSPG2、SYK、GRB2、PDGFD、SHC1、HRAS、FGFR2、PDGFC、PIK3R1、NTRK1、AKT1和ITGB3。

圖4 與PDGFA基因編碼蛋白存在緊密互作關(guān)系的蛋白

該20個(gè)蛋白編碼基因與PDGFA基因一起經(jīng)DAVID數(shù)據(jù)庫功能富集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們主要參與了12個(gè)生物學(xué)過程(biological process，BP)、4個(gè)細(xì)胞組分(cellular component，CC)、3個(gè)分子功能(molecular function，MF)和11個(gè)信號通路(KEGG pathway，KEGG)，見圖5。

2.3PDGFA基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 依據(jù)PDGFA基因在PubMed、MeSH、KEGG等數(shù)據(jù)庫中與其他基因的關(guān)系，構(gòu)建PDGFA基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(見圖6)?？梢?，許多基因可作為PDGFA基因的下游基因，許多蛋白、microRNA也與PDGFA具有相互作用，激活和促進(jìn)PDGFA。

2.4PDGFA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子預(yù)測 依據(jù)Transfac數(shù)據(jù)庫的預(yù)測分值和COSMIC數(shù)據(jù)庫是否存在對應(yīng)注釋信息預(yù)測得出PDGFA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子(見圖7)?？梢?，許多因子可能作為PDGFA基因的上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，對PDGFA起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。

3 討論

腫瘤的生長是腫瘤細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞與局部微環(huán)境相互作用的結(jié)果。腫瘤細(xì)胞的黏附、侵入、定植、生長、轉(zhuǎn)移等受到多種因素的影響。PDGF是平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長所必需的血清衍生組分[8]。前期多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)[3-7]，PDGFA與多種腫瘤密切相關(guān)，腫瘤細(xì)胞分泌的PDGFA可以促進(jìn)多種細(xì)胞的生長以及腫瘤細(xì)胞自身的黏附、生長與轉(zhuǎn)移。此次，我們通過基因芯片數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)PDGFA基因在正常鼻咽黏膜組織與鼻咽癌組織中亦有差異表達(dá)，并且PDGFA基因在鼻咽癌組織中明顯上調(diào)。

注：BP：生物學(xué)程序；CC：細(xì)胞組分；MF：分子功能；KG：信號通絡(luò)。

圖6 PDGFA基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

圖7 PDGFA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子預(yù)測

分子表達(dá)有差異是探索分子功能的前提。于是，我們對PDGFA基因的功能、參與通路、與其它基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及其轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測等方面進(jìn)行了分析。通過分析，我們發(fā)現(xiàn)PDGFA基因的分子功能和參與的生物學(xué)過程與細(xì)胞增殖正調(diào)控、細(xì)胞遷移的正調(diào)控、黏著、ERK1和ERK2級聯(lián)的正調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)自磷酸化的正調(diào)控等密切相關(guān)。富集到的許多通路，如MAPK信號通路[9]、Jak-STAT信號通路[10]、mTOR信號通路[11]等也都與癌癥的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。這進(jìn)一步說明了PDGFA與腫瘤的密切程度。由此可見，PDGFA基因亦可能通過這些功能和途徑對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展起重要作用。

PDGFA基因的共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，許多基因如INSRR、TEK、NGFR、MET、KIT、KDR、INSR、IGF1R、FLTA、EPHA2、EGFR、CSF1R等都可以作為PDGFA基因的下游基因，與PDGFA發(fā)生作用，通過Ras信號通路、PI3K-Akt信號通路[12]、MAPK信號通路等多種通路參與各種代謝途徑、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動(dòng)。另PDGF的受體基因——PDGFRB、PDGFRA也可以與PDGFA基因相互作用，參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥、間隙連接等。還有，許多轉(zhuǎn)錄因子對PDGFA基因也起重要的調(diào)控作用，如Sp1、Sp3和Egr-1可以對PDGFA正調(diào)控，GCF2、NF-1(X)和WT-1可以對PDGFA負(fù)調(diào)控，c-Ets-1通過與Sp1的協(xié)同作用，可促進(jìn)PDGFA基因轉(zhuǎn)錄和血管平滑肌細(xì)胞生長[13]；一些蛋白，如SPARC、PDGFB、PDGFRA等也與PDGFA關(guān)聯(lián)緊密，具有蛋白相互作用[14]。另外，從共表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖中，還可以看到PDGFA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控還涉及非編碼RNA的相互作用。許多microRNA，如miR-203a-5p、miR-1273g-6p、miR-7110-3p、miR-6817-3p、miR-130b-5p、miR-6873-3p、miR-4753-3p、miR-4768-5p可以靶向PDGFA，或被PDGFA誘導(dǎo)改變，這進(jìn)一步揭示了PDGFA在參與癌細(xì)胞發(fā)生發(fā)展過程中還可能與PDGF受體信號的microRNA依賴性反饋機(jī)制有關(guān)[15]。

轉(zhuǎn)錄因子是控制基因表達(dá)的重要分子，直接控制基因表達(dá)的時(shí)間、地點(diǎn)和程度，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄。基于每個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄本(Ensembl數(shù)據(jù)庫注釋)對起始位點(diǎn)上游2000bp、下游500bp通過Transfac數(shù)據(jù)庫進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測結(jié)果，向我們展示了可能對PDGFA基因起調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子，如ZN451、ZFP532、ZBTB7B、ZBTB44、WT1、UF1H3BETA、SOX10、GABPA、AP2REP、BEN等。PDGFA基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子預(yù)測為我們今后繼續(xù)探討鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制提供了一定方向。

綜上所述，PDGFA在正常鼻咽黏膜組織與鼻咽癌組織中有差異表達(dá)。PDGFA與細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等密切相關(guān)，其可能與microRNA、互作蛋白、下游基因、上游轉(zhuǎn)錄因子等相互作用，通過多種途徑發(fā)揮功能，從而參與鼻咽癌的發(fā)生、發(fā)展與轉(zhuǎn)移。