2黃贊松2

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，廣西肝膽疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣西 百色 533000)

肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的原發(fā)性肝癌，也是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥相關(guān)死亡原因之一[1]。肝癌的主要治療方法包括肝移植、手術(shù)切除和化療，然而，肝癌易發(fā)生轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者確診時(shí)已錯(cuò)過手術(shù)治療的時(shí)機(jī)。即使是分子靶向治療，一線化療藥應(yīng)答率也很低[1]，而化療具有化療耐藥性[2]，而部分肝癌患者甚至術(shù)后亦可能發(fā)生轉(zhuǎn)移，因此，HCC的治療已成為目前全世界面臨的難題。研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)與惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲密切相關(guān)[3]，還有研究表明[4]，miR-204在腫瘤細(xì)胞EMT過程中發(fā)揮了重要的作用。因此，探究能夠有效抑制EMT過程的藥物是控制細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的前提?？鄥⑺?(oxymatrine，OM)，是傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物活性成分，具有抗炎、抗過敏、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種藥理活性，我們實(shí)驗(yàn)組前期實(shí)驗(yàn)證明，其在抑制HCC的EMT作用中有明顯作用[5]，然而OM抑制肝癌細(xì)胞EMT作用的機(jī)制尚未完全明確，因此本文將探究OM抑制肝癌細(xì)胞EMT作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人肝癌HepG2細(xì)胞由右江民族醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院廖長秀博士惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；OM購自鄭州卓峰制藥有限公司(批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20033744，規(guī)格2ml：0.2g)；CCK8購自美國MCE公司；6孔板、96孔板購于美國Thermo公司，25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶購于美國Corning公司，上皮轉(zhuǎn)化因子-β1(TGF-β1)購于美國PEPROTECH公司，總RNA提取試劑盒RNAiso Plus(Code No.9108)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒miR-X TMII(Code No.RR820A)、氯仿、異丙醇、國產(chǎn)分析純75%的乙醇，其中用0.1%DEPC水配制75%乙醇，將其放入4℃冰箱保存；提取RNA、逆轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增過程中所用的槍頭、EP 管等均購自Axygen公司，以防RNA降解使用前均去RNA酶處理。兔抗E-Cadherin、Vimentin、GAPDH購自美國Cell Signal Technology公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G購自Affinity公司；高效RIPA裂解液、蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、蛋白marker、BCA法蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、P-ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自雅酶公司；SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自上海碧云天公司。

1.2 人肝癌細(xì)胞HepG2 EMT模型建立與實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1 HepG2細(xì)胞株的培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞株需在含10%胎牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中，并在37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁生長于25 cm2corning培養(yǎng)瓶中，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 人肝癌細(xì)胞HepG2 EMT模型建立 收集對數(shù)期HepG2細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100微升/孔，每孔含2×105個(gè)細(xì)胞)，根據(jù)文獻(xiàn)[6]的方法構(gòu)建人肝癌細(xì)胞EMT模型，在細(xì)胞培養(yǎng)板中加入TGF-β1使其終濃度為10 ng/ml，以未用TGF-β1培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照組，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，在光學(xué)顯微鏡下觀察對照組和模型組細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 處理實(shí)驗(yàn)分為6個(gè)組，空白組、模型組、OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組、OM 8 mg/ml組，每組細(xì)胞均在6孔板中培養(yǎng)48 h。

1.3 實(shí)驗(yàn)檢測

1.3.1 CCK8檢測各組OM對已發(fā)生EMT作用的HepG2細(xì)胞的增殖抑制情況 取對數(shù)生長期細(xì)胞，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整至合適的細(xì)胞密度，接種至96孔板，使每孔含1×104個(gè)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為：空白組、模型組、OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組，OM 8 mg/ml組。次日，在模型組、OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組、OM 8 mg/ml組中各加入濃度為10 ng/ml的TGF-β1，對照組加等量培養(yǎng)基，作用24 h。第3天，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組，OM 8 mg/ml組各加入含OM濃度為1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml的完全培養(yǎng)基，作用12 h、24 h、48 h、72 h后，于450 nm波長檢測各組吸光度值(A值)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。抑制率計(jì)算公式：抑制率=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對照組A值)/(陰性對照組A值-空白對照組A值)]×100%。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 檢測HepG2細(xì)胞中miR-204表達(dá)水平 將對數(shù)期HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，除空白組外，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組均使用TGF-β1誘導(dǎo)24 h，再使用1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml OM作用48 h。采用RNAiso Plus提取HepG2細(xì)胞總RNA，并用紫外分光光度計(jì)檢測總RNA濃度；隨后采用Takara公司5×PrimeScript RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，以Takara公司2×SYBR Premix Ex Taq II試劑盒實(shí)時(shí)定量PCR檢測上述不同組細(xì)胞樣本中miR-204，miR-204引物由上海寶生物公司合成，引物序列為：TCCCTTTGTCATCCTATGCCTAA。反應(yīng)體系：ddH2O 9.5 μl，SYBR Premix Ex TaqTMⅡ12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，cDNA模板2 μl。PCR反應(yīng)條件為：95℃ 30 s， 95℃ 5 s，60℃ 30 s，共擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。溶解曲線分析：95℃ 5 s，60℃ 60 s，95℃ 30 s。U6作為miRNA表達(dá)的內(nèi)參照，使用2-△△法分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HepG2細(xì)胞遷移能力 將對數(shù)期HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，除空白組外，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組均使用TGF-β1誘導(dǎo)24 h，再使用1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml OM作用48 h。將各組HepG2細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞數(shù)目(1×106/ml)，接種至96孔板，細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入1 ml單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞密度達(dá)80%時(shí)，用滅菌過的10μl槍頭劃線，用PBS洗去劃痕中的細(xì)胞，加入空白培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率計(jì)算：愈合率=(原始創(chuàng)面面積-未愈合創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

1.3.4 Western Blot檢測HepG2細(xì)胞中鈣黏附蛋白-E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)情況 將對數(shù)期HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，除空白組外，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組均使用TGF-β1誘導(dǎo)24 h，再使用1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml OM作用48 h。經(jīng)OM作用48 h后，提取各組總蛋白，BCA法檢測各組總蛋白濃度，100℃加熱變性，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳反應(yīng)，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)各蛋白分子量設(shè)定，60～150 min不等，加入無蛋白快速封閉液于室溫封閉10 min，洗膜3次，每次5 min，然后分別加入相應(yīng)的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗去膜上未結(jié)合的一抗，10分/次，洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G，室溫孵育2 h，TBST 洗去未結(jié)合的二抗，10分/次，共洗3次，之后加入ECL發(fā)光液進(jìn)行曝光顯影，使用Image J軟件分析各條帶灰度值，計(jì)算各蛋白表達(dá)量(目的蛋白條帶吸光度值/內(nèi)參照條帶吸光度值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取均值。

2 結(jié)果

2.1 人肝癌HepG2細(xì)胞EMT模型建立 從圖1可以看出，對照組人肝癌細(xì)胞HepG2多為抱團(tuán)生長，細(xì)胞排列緊密，經(jīng)TGF-β1 誘導(dǎo)后其形態(tài)發(fā)生變化； 模型組人肝癌細(xì)胞HepG2呈現(xiàn)梭形和紡錘形，且細(xì)胞間隙變大、排列松散。表明人肝癌細(xì)胞HepG2 EMT模型構(gòu)建成功。

注：A：對照組；B：模型組。

2.2 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測OM對已發(fā)生EMT作用的人肝癌細(xì)胞HepG2的影響 圖2結(jié)果顯示，OM對已發(fā)生EMT作用的HepG2細(xì)胞增殖呈抑制作用，OM濃度分別為1 mg/ml、2 mg/ml、4 mg/ml、8 mg/ml，隨著OM濃度的增加，其對已發(fā)生EMT作用的人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制率增加，且組間抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。由于OM濃度為8 mg/ml時(shí)肝癌細(xì)胞存活較少，無法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，故后面的實(shí)驗(yàn)將去掉OM 8 mg/ml組。

圖2 OM對已發(fā)生EMT作用的人肝癌細(xì)胞HepG2抑制率的比較 (n=3)

2.3 qRT-PCR檢測人肝癌細(xì)胞 HepG2中miR-204表達(dá)水平 圖3結(jié)果顯示，模型組和OM組HepG2細(xì)胞中miR-204表達(dá)水平高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4mg/ml組HepG2細(xì)胞中miR-204表達(dá)水平增高(P<0.05)。

注：與空白組比較，a：P<0.05；與模型組比較，b：P<0.05。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測人肝癌細(xì)胞HepG2遷移情況 圖4結(jié)果顯示，模型組HepG2細(xì)胞遷移能力高于空白組(P<0.05)；與模型組相比，OM 4 mg/ml組HepG2細(xì)胞遷移能力降低(P<0.05)。

注：A：對照組；B：模型組；C：OM 1mg/ml組；D：OM 2mg/ml組；E：OM 4mg/ml組。

2.5 Western Blot 檢測HepG2細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin表達(dá)情況 圖5結(jié)果顯示，模型組HepG2細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)水平低于空白組(P<0.05)，而Vimentin表達(dá)水平升高(P<0.05)；OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組HepG2細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)，而Vimentin表達(dá)水平降低(P<0.05)。

2.6 OM作用48 h后，HepG2細(xì)胞中miR-204的表達(dá)量與其增殖抑制率的相關(guān)性 經(jīng)Spearman分析顯示，OM作用48 h后，HepG2細(xì)胞中miR-204的表達(dá)量與其增殖抑制率呈正相關(guān)(r=0.965，P<0.05)。

2.7 OM作用48 h后，HepG2細(xì)胞中miR-204的表達(dá)量與E-cadherin、Vimentin表達(dá)量的相關(guān)性 經(jīng)Spearman分析顯示，OM作用48h后，HepG2細(xì)胞中miR-204的表達(dá)量與其E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.767，P<0.05)，miR-204的表達(dá)量與其Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.765，P<0.05)。

圖5 HepG2細(xì)胞中 E-cadherin、Vimentin相對表達(dá)量 (n=3)

3 討論

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在建立EMT模型的基礎(chǔ)上，使用不同濃度的OM處理HepG2 EMT模型，OM可抑制HepG2 EMT模型的增殖并可以減弱已發(fā)生EMT的HepG2細(xì)胞的的遷移能力；進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)OM可以上調(diào)HepG2細(xì)胞中miR-204表達(dá)水平、提高HepG2細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)水平和下調(diào)Vimentin表達(dá)水平。

肝癌是最常見的消化道腫瘤，在中國，肝癌在癌癥相關(guān)死亡率中排名第二[7]。肝癌易轉(zhuǎn)移的特性給肝癌的治療帶來巨大的困難。EMT是指上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為更具遷移和侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞的生物過程。有研究表明，EMT在原發(fā)性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要的作用[8-9]，且EMT 與肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[10-12]，因而，抑制肝癌細(xì)胞的EMT過程對于肝癌的治療和提高患者的生存率具有重要的意義。OM是傳統(tǒng)中藥苦參的主要生物活性成分，具有抗炎、抗過敏、抗纖維化、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種藥理活性。近年來有關(guān)中西藥治聯(lián)合療肝癌的研究取得較大進(jìn)展，OM也成為臨床實(shí)驗(yàn)研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，氧化苦參堿具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖[13]、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化凋亡[14]、抑制腫瘤細(xì)胞黏性與浸潤轉(zhuǎn)移以及增強(qiáng)化療藥的作用[15]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，OM可抑制人肝HepG2細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。在進(jìn)一步研究中證明，OM可通過削弱人肝癌HepG2細(xì)胞的EMT作用，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞多藥耐藥[5]，證明OM可以削弱肝癌細(xì)胞的EMT作用，但其作用的分子機(jī)制尚未完全明確。

本研究采用TGF-β1誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞HepG2后，模型組細(xì)胞呈現(xiàn)梭形和紡錘形，且細(xì)胞間隙變大、排列松散，表明人肝癌細(xì)胞EMT模型構(gòu)建成功；在建立EMT模型的基礎(chǔ)上，使用不同濃度的OM處理HepG2 EMT模型，發(fā)現(xiàn)OM可抑制HepG2 EMT模型的增殖，且呈現(xiàn)劑量效應(yīng)。除此之外，為了進(jìn)一步了解OM作用于已發(fā)生EMT的HepG2細(xì)胞后，其遷移能力的變化，我們做了劃痕檢測，發(fā)現(xiàn)模型組的細(xì)胞遷移能力高于空白組，而OM 1 mg/ml組、OM 2 mg/ml組、OM 4 mg/ml組HepG2細(xì)胞遷移能力低于模型組，且遷移能力隨著OM濃度的升高呈降低趨勢，結(jié)果表明，OM可以減弱已發(fā)生EMT的HepG2細(xì)胞的遷移能力。而為了在分子水平上進(jìn)一步確認(rèn)OM組的HepG2細(xì)胞是否發(fā)生EMT過程的減弱，本實(shí)驗(yàn)對E-cadherin、Vimentin這兩個(gè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的標(biāo)志性蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OM組HepG2細(xì)胞中E-cadherin 表達(dá)水平高于模型組，Vimentin表達(dá)水平低于模型組，表明OM能夠逆轉(zhuǎn)人肝癌細(xì)胞HepG2 EMT過程，且其作用與濃度呈正比。

文獻(xiàn)報(bào)道[16-21]，miR-204在其他腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌因子的角色，且其表達(dá)的變化可影響腫瘤細(xì)胞EMT作用。有研究發(fā)現(xiàn)[22]，miR-204參與肝癌EMT過程，與肝癌的侵襲和遷移密切相關(guān)，為明確miR-204在肝癌中與HepG2細(xì)胞的增殖以及EMT過程的關(guān)系，我們使用qRT-PCR對miR-204進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OM作用48 h后，HepG2細(xì)胞中的miR-204表達(dá)量增高，且miR-204的表達(dá)量隨OM濃度的增高而增高，且miR-204的表達(dá)量與HepG2細(xì)胞增殖抑制率呈正相關(guān)，miR-204的表達(dá)量與HepG2細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)，miR-204的表達(dá)量與HepG2細(xì)胞中Vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，隨著miR-204的表達(dá)量的增高，HepG2細(xì)胞的EMT作用呈削弱趨勢，推測OM可上調(diào)HepG2細(xì)胞中miR-204的表達(dá)，并且OM可通過上調(diào)miR-204表達(dá)，減弱HepG2細(xì)胞的EMT作用，也可通過上調(diào)miR-204表達(dá)進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

綜上所述，我們的初步研究發(fā)現(xiàn)OM可上調(diào)HepG2細(xì)胞中miR-204表達(dá)，進(jìn)而抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖、遷移及削弱其 EMT 過程，其實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)為OM治療HCC提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。