王居平，趙靜，周青宏，巫祥生，農(nóng)安娜，華浩銘，楊樹琳，陳麗瑩，任瑞華2，彭慧

(1. 右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000；2. 贛南醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000)

胃癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，占我國癌癥發(fā)病率的第四位，并呈上升趨勢。早期多無明顯臨床癥狀，往往就診時已到中晚期，且大多數(shù)患者因發(fā)生轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)的最佳時機[1-2]。因此，了解胃癌的發(fā)生發(fā)展機制并尋求特異的療法是當務(wù)之急。免疫球蛋白(Ig)是人體中極其重要的蛋白質(zhì)，廣泛存在于血漿、組織液和分泌液中，參與機體的免疫反應(yīng)。傳統(tǒng)的免疫學(xué)理論認為，只有B淋巴細胞和漿細胞才能產(chǎn)生和分泌Ig，但近年來國內(nèi)外多個研究組發(fā)現(xiàn)胃癌、乳腺癌、肺癌、宮頸癌等多種癌細胞也能表達Ig，特別是IgG[3-6]。更重要的是，與經(jīng)典IgG不同，非B細胞來源的IgG參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[7-11]。近年來許多研究顯示，ATP酶中的P-ATP酶如Na+-K+-ATP酶、H+/K+-ATP酶不僅參與正常的細胞活動，如維持細胞內(nèi)外鈉、鉀離子的生理分布，也參與了包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12-15]。本研究旨在通過探討Na+-K+-ATP酶在腫瘤源性IgG促進胃癌細胞增殖中的作用和機制研究，為胃癌的診斷和防治提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞株和裸鼠 人胃癌細胞SGC-7901和HGC-27購于武漢普諾賽生命科技有限公司，12只4～5周齡BALB/c 裸鼠購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶購于Gibco公司；Control siRNA片段序列正義鏈為5′ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′，反義鏈為5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT3′，IGH-G1siRNA片段序列正義鏈為5′CCAAGGACACC-CUCAUGAUTT3′，反義鏈為5′AUCAUGAGGGUGUCCUUGGTT3′，siRNA片段和shRNA質(zhì)粒載體購于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購于美國Invitrogen公司；10XRI-PA裂解緩沖液購于美國Upstate公司；CCK-8試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；ATP酶試劑盒購于南京建成生物工程研究所；BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；鼠抗人IgG(γ鏈特異性)抗體購于美國Sigma公司；ECL發(fā)光液購于美國Merck Millipore公司；遺傳霉素G418和兔抗人β-actin抗體購于生工生物工程(上海)股份有限公司；RT-qPCR相關(guān)試劑購于寶生物工程(大連)有限公司；免疫組化試劑購于北京索萊寶生物技術(shù)公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和siRNA干擾實驗 將SGC-7901細胞置于含有10%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，將HGC-27細胞置于含有20%胎牛血清、100 U/ml青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞貼壁達80%時，用0.25%的胰酶消化細胞，進行傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。轉(zhuǎn)染前使細胞在六孔板中達到50%～60%的融合，用LipofectamineTM2000將IGHG1 siRNA和Control siRNA片段轉(zhuǎn)染進入以上兩種細胞，72 h后收細胞進行后續(xù)實驗。

1.4 胃癌穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的建立和裸鼠成瘤實驗 將Control shRNA和IGHG1 shRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染到HGC-27細胞中，用G418篩選出最佳藥物濃度后并處理細胞，經(jīng)過4～6周的篩選，最終得到穩(wěn)定表達Control shRNA和IGHG1 shRNA的單克隆細胞系。將此細胞5×107個溶于200 μl PBS中，注射到裸鼠的皮下，實驗組和對照組裸鼠各6只。8周后將以上裸鼠麻醉處死，取出裸鼠腫瘤并拍照。對于裸鼠腫瘤組織，在完成HE染色后用免疫組化技術(shù)檢測以上組織增殖相關(guān)標志物PCNA和Ki67的表達。

1.5 免疫印跡實驗 收集siRNA干擾后的細胞樣品，裂解后測定細胞蛋白濃度，每個樣品取50 μg蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用5%牛奶封閉2 h，PBST洗膜后，加入一定稀釋倍數(shù)的一抗，4℃孵育過夜，第2天用PBST洗膜后在室溫孵育HRP標記的二抗1 h，PBST洗膜后加入ECL發(fā)光液在暗室用膠片曝光，以β-actin為內(nèi)參照。

1.6 RT-qPCR 用RNAsio Plus試劑提取細胞總RNA后，按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)TB Green○RPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)試劑盒說明書，加入相應(yīng)反應(yīng)體系，用羅氏Lightcycler96熒光定量PCR儀檢測CT值。使用2-△△Ct法分析IGHG1在mRNA水平的相對表達量。

1.7 細胞增殖實驗 在SGC-7901和HGC-27細胞中均轉(zhuǎn)染Control siRNA和IGHG siRNA片段，將轉(zhuǎn)染Control siRNA片段的細胞定為對照組，轉(zhuǎn)染IGHG1 siRNA片段的細胞定為實驗組。轉(zhuǎn)染6 h后，胰酶消化并進行細胞計數(shù)，每孔2000個細胞，在96孔板中接種細胞懸液(100微升/孔)，72 h后，根據(jù)細胞增殖檢測試劑盒說明書，向細胞中加入10 μl CCK-8試劑，放入細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h，在Bio-Rad酶標儀上測定490 nm波長處的吸光度值。在實驗過程中設(shè)置空白對照組，每組細胞做6個重復(fù)。

1.8 Na+-K+-ATP酶活性測定 轉(zhuǎn)染72 h后將細胞收集加入500 μl生理鹽水，用超聲破碎儀破碎細胞，400安培10秒/次，間隙20 s，反復(fù)5～10次，1000 r/min，離心5 min，取上清液測量細胞蛋白濃度以及總ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性。根據(jù)酶促反應(yīng)釋放的無機磷含量測定ATP酶活性，按照試劑盒說明書要求逐項加入試劑，最后用紫外分光光度計在636 nm處測定樣品吸光度。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)下調(diào)胃癌細胞中IgG表達 在SGC-7901和HGC-27細胞中均轉(zhuǎn)染Control siRNA片段(對照組)和IGHG1 siRNA片段(實驗組)。轉(zhuǎn)染72 h后收細胞，用免疫印跡技術(shù)和RT-qPCR技術(shù)分別檢測以上細胞中IgG的表達。結(jié)果表明，與對照組細胞相比，實驗組細胞中IgG在蛋白(見圖1A和圖1C)和mRNA水平(見圖1B和圖1D)的表達降低(P<0.01)。

注：圖1B，P=0.002；圖1D，P=0.003；**表示P<0.01。

2.2 體外實驗證明腫瘤源性IgG表達下調(diào)抑制胃癌細胞增殖 在SGC-7901和HGC-27細胞中均轉(zhuǎn)染Control siRNA片段(對照組)和IGHG1 siRNA片段(實驗組)。在轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染3 d后，分別用顯微鏡觀察并進行拍照，隨機取以上兩種細胞的10個不同視野，對每個視野的細胞進行計數(shù)并進行方差分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染3 d后，與對照組細胞相比，實驗組細胞數(shù)量顯著減少(P<0.01)(見圖2A和圖2C)。在以上細胞中分別轉(zhuǎn)染Control siRNA(對照組)和IGHG1 siRNA(實驗組)片段，72h后用CCK-8法檢測細胞增殖情況。結(jié)果表明，與對照組細胞相比，實驗組細胞IgG表達下調(diào)抑制胃癌細胞SGC-7901(見圖2B)和HGC-27(見圖2D)增殖。

注：圖2A，P<0.001；圖2B，P=0.033；圖2C，P=0.003；

2.3 體內(nèi)實驗證明敲低腫瘤源性IgG表達阻礙胃癌細胞增殖 本實驗通過G418篩選構(gòu)建了穩(wěn)定表達Control shRNA(對照組)和IGHG1 shRNA(實驗組)的HGC-27胃癌細胞系并檢測了IgG在蛋白和mRNA水平的表達，隨后將以上穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞注射進BALB/c 裸鼠背部兩側(cè)皮下，8周后測量裸鼠瘤體大小，摘除腫瘤組織后完成HE染色，檢測與腫瘤增殖相關(guān)的標志物PCNA、Ki67和陰性對照PBS表達水平。結(jié)果表明，以上穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞中IgG在蛋白和mRNA(見圖3A和圖3B)水平的表達都降低(P<0.01)。與對照組相比，實驗組裸鼠腫瘤體積減少(見圖3C)，PCNA和Ki67的表達也降低(P<0.05)(見圖3D)。

2.4 腫瘤源性IgG表達下調(diào)降低胃癌細胞中Na+-K+-ATP酶活性 轉(zhuǎn)染72 h后收集細胞并用超聲裂解細胞，取上清分別檢測總ATP酶和Na+-K+-ATP酶活性。結(jié)果表明，與對照組細胞相比，實驗組細胞中以上2種ATP酶活性均降低(P<0.05)(見圖4A和圖4B)。

注：圖3B，P=0.001；圖3D，PPCNA=0.013，PKi67=0.011；*表示P<0.05，**表示P<0.01比例尺20 μm(每組比例尺相同，故每組只畫了第一張圖片)。

注：圖4A，P=0.04，P=0.007；圖4B，P=0.039，P=0.049；*表示P<0.05，**表示P<0.01。

3 討論

ATP在生物體內(nèi)各種生命活動中發(fā)揮重要作用。目前發(fā)現(xiàn)至少有三類ATP酶，分別為：P-ATP酶、F-ATP酶、V-ATP酶[16]。P-ATP酶分布在真核細胞的質(zhì)膜、少數(shù)細胞器膜和大腸桿菌、鏈球菌的內(nèi)膜[17]。F-ATP酶是一類結(jié)構(gòu)最復(fù)雜、研究最深入的質(zhì)子泵ATP酶，存在于細菌內(nèi)膜、葉綠體的類囊體和線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)[18]。V-ATP酶存在于真核細胞內(nèi)的空泡型細胞器上，如酵母、真菌的空泡，植物的液泡，動物的溶酶體、籠蛋白衣被小泡、嗜鉻顆粒、突觸小泡和分泌小泡等[18-19]。Na+-K+-ATP酶屬于P-ATP酶，能維持線粒體膜電化學(xué)梯度，是線粒體功能、結(jié)構(gòu)變化的靈敏指標[20]。Na+-K+-ATP酶為三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，由α、β和γ 3個亞單位組成。其中α-亞單位是一種跨膜蛋白，可促進細胞內(nèi)外K+和Na+之間交換，進而調(diào)節(jié)體內(nèi)外離子間的動態(tài)平衡[21]。由于Na+-K+-ATP酶在機體內(nèi)扮演多種重要的角色，因此Na+-K+-ATP酶表達和活性改變將誘發(fā)多種疾病[22]，并且癌細胞中Na+-K+-ATP酶表達和活性改變將影響其(其代表癌細胞)發(fā)生發(fā)展[23]。有報道指出[24]，下調(diào)Na+-K+-ATP酶(同前，均為Na+-K+-ATP酶)α1亞基的表達抑制非小細胞肺癌的增殖和遷移。使用Na+-K+-ATP酶抑制劑將抑制肝癌細胞HepG2的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡[25]。Li L等[26]發(fā)現(xiàn)Na+-K+-ATP酶β3亞基在人的胃癌組織中顯著升高，并通過PI3/AKT信號通路促進胃癌細胞的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后。我們認為Na+-K+-ATP酶可能通過PI3/AKT信號通路影響細胞增殖。除此之外，Na+-K+-ATP酶的活性取決于細胞內(nèi)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和膽固醇。有研究表明[27-30]，PS能夠穩(wěn)定Na+-K+-ATP酶的表達，卵磷脂(phosphatidylcholine，PC)和腦磷脂(phosphatidylethanolamine，PE)能夠和Na+-K+-ATP酶相互作用進而增強其活性。Habeck M等[31]研究發(fā)現(xiàn)，Na+-K+-ATP酶的功能被PS和膽固醇(PC、PE)調(diào)節(jié)，此過程取決于磷脂的結(jié)構(gòu)特異性、特異的結(jié)合位點和特定的動力學(xué)機制。我們推測，癌源性IgG可能通過調(diào)節(jié)PS和膽固醇(PC、PE)來增強Na+-K+-ATP酶的活性進而促進胃癌細胞增殖，我們將在后續(xù)的實驗中驗證這一推論。

本研究從體內(nèi)和體外兩方面證明，下調(diào)胃癌細胞中IgG表達后，細胞增殖明顯受到抑制，進一步探究其機制，我們發(fā)現(xiàn)在以上胃癌細胞增殖受到抑制的同時，Na+-K+-ATP酶和總ATP酶的活性均顯著降低，該結(jié)果與以前報道的結(jié)果相一致。此外，Na+-K+-ATP酶已被證實促進胃癌細胞增殖[26，32]。

綜上所述，我們認為IgG可能通過增強胃癌細胞中Na+-K+-ATP酶活性促進細胞增殖(見圖5)。下一步，我們將就IgG是否確實通過影響Na+-K+-ATP酶活性促進胃癌細胞增殖做進一步探索。

圖5 腫瘤源性IgG促進胃癌細胞增殖機制圖