楊曉培，倪楊帆，趙 靜，萬 云，黎 巧，肖 冉，岳 龍，黃 微，袁曉丹，楊 洋，謝文浩，阮 征

（1.武漢市動物疫病預(yù)防控制中心，武漢 430070；2.武漢農(nóng)業(yè)檢測中心，武漢 430014）

細菌性腦膜炎是一種嚴重危及生命的疾病，它是由于細菌感染導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病率和死亡率較高。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)不斷進步，診斷技術(shù)和針對性的抗生素治療手段不斷完善，細菌性腦膜炎的診療情況有所進展，但由于其難以確診、病程發(fā)展迅速、缺少有效的疫苗預(yù)防等特點，仍嚴重威脅著人類的生產(chǎn)和生活。在我國，腸外致病性大腸桿菌（ExPEC）作為一種人畜共患病細菌，菌群耐藥情況復(fù)雜，大多數(shù)細菌性腦膜炎病例由血源性擴散引起，當循環(huán)的細菌穿透血腦屏障（BBB）時，將破壞腦實質(zhì)并最終引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，近一半的幸存者患有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)疾?。ㄈ缰橇t鈍、聽力障礙和失明）。數(shù)據(jù)顯示，在不同地域和不同年齡段，ExPEC 導(dǎo)致的細菌性腦膜炎病例占全部病例的50%；在3 歲以下的兒童群體中，該病的死亡率達21%，10%～20%的幸存患者會出現(xiàn)認知障礙、雙側(cè)聽力喪失、運動障礙、癲癇、視力受損和腦積水等神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥［1，2］。

1 豬源腸外致病性大腸桿菌的研究

目前，大腸桿菌致腦膜炎主要以K1莢膜菌株為研究對象［3］。研究發(fā)現(xiàn)，感染PCN033 菌株的小鼠腦組織的病理切片顯示出明顯的腦膜炎病變［4］。PCN033菌株屬于臨床分離的豬源ExPEC，是1種K2莢膜菌株，現(xiàn)對其在細菌性腦膜炎機制的研究進展進行探討。

ExPEC 與毒力相關(guān)的因子包括脂多糖（LPS）、莢膜、菌毛、鞭毛、生物被膜、分泌系統(tǒng)、鐵離子攝取與轉(zhuǎn)運系統(tǒng)等，這些毒力因子在引起細菌性腦膜炎的過程中起到重要作用。LPS 作為革蘭氏陰性菌細胞膜的主要成分，可在宿主體內(nèi)誘發(fā)強烈的免疫反應(yīng)。Bao 等［5］發(fā)現(xiàn)，在引起腦膜炎的過程中，LPS 能夠結(jié)合機體產(chǎn)生的溶菌酶，降低溶菌酶活性，從而減弱溶菌酶對細菌的殺傷作用。莢膜是細菌的表面抗原，耐干燥、促進細菌與細胞表面、細菌之間的黏附、抵抗宿主免疫系統(tǒng)。Kim［3］發(fā)現(xiàn)，細菌表面K1 莢膜能夠抑制溶菌酶與內(nèi)吞小泡結(jié)合，有利于細菌存活、繁殖，最終跨越BBB 進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。菌毛、鞭毛菌有黏附細胞的功能，且鞭毛與生物被膜的形成有關(guān)。Liu 等［6］在研究鞭毛系統(tǒng)對hBMEC粘附作用時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lag-1 系統(tǒng)在鞭毛結(jié)構(gòu)的合成和成熟中起到重要作用，編碼鞭毛鉤支架蛋白的flgD基因是介導(dǎo)細菌游動和群集的重要蛋白，flgD缺失可減弱ExPEC菌株在體內(nèi)的侵襲和定殖。

2 豬源腸外致病性大腸桿菌感染hBMECs組學(xué)研究

BBB 主體結(jié)構(gòu)由單層hBMECs 有秩序的排列形成致密層，這種致密的結(jié)構(gòu)可以將腦和血管內(nèi)的空間隔離開來，同時細胞頂部和細胞基底外側(cè)的表面蛋白發(fā)生極化。Liu 等［7］、Yang 等［8］通過將PCN033與hBMECs 互作后收集細胞，分別提取hBMECs 蛋白和RNA，比較感染前后hBMECs 蛋白和RNA 的變化，尋找豬腸外致病性大腸桿菌致人腦膜炎關(guān)鍵分子。

2.1 蛋白組學(xué)研究

Liu等［7］通過比較感染前后蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)，主要有2 大類蛋白的表達發(fā)生了改變，他們分別參與了PCN033 誘導(dǎo)的緊密連接損壞和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）促進了腦膜炎大腸桿菌誘導(dǎo)細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，并通過降低ZO-1、occludin 等緊密連接蛋白，有助于破壞血腦屏障；同時發(fā)現(xiàn)NF-κB 和MAPK 信號通路在hBMECs對腦膜炎大腸桿菌的響應(yīng)中起主導(dǎo)作用，主要包括IL-6、IL-8、TNF-α 和IL-1β 在內(nèi)的促炎細胞因子的產(chǎn)生。

2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

近年來，長鏈非編碼RNA（lncRNA）和環(huán)狀RNA（CircRNA）的研究主要集中在腫瘤方面，他們在細菌性腦膜炎中的調(diào)節(jié)作用還尚不明確。通過RNA測序，Yang 等［8］發(fā)現(xiàn)PCN033 感染hBMECs 中有25 257 個lncRNA 發(fā) 生改 變，包括24 645 個 已注 釋和612 個新發(fā)現(xiàn)的；共有895 個lncRNA 表現(xiàn)出顯著差異，其中有382個上調(diào)，513個下調(diào)，通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測了lncRNA 的特征以及l(fā)ncRNA 與mRNA之間潛在的調(diào)控關(guān)系。Yang 等［9］通過組學(xué)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)細菌性腦膜炎相關(guān)RNA，進一步驗證發(fā)現(xiàn)了hsa-miR-93-5p 與血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）之間的負調(diào)控關(guān)系，hsa_circ_2858 可以競爭結(jié)合hsamiR-93-5p；hsa_circ_2858 過表達之后，VEGFA 表達顯著上調(diào)，但同時對hsa-miR-93-5p 進行過表達后，hsa_circ_2858對于VEGFA 的上調(diào)作用受到了完全的抑制［9］。

Yang 等［10］在PCN033 感染星形膠質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，有2 045 個mRNA、74 個lncRNA、27 個miRNA 和418 個circRNA 被差異表達。星形膠質(zhì)細胞中mRNA 顯著上調(diào)主要與TNF、HIF-1、NF-κB、MAPK 等炎癥信號通路及凋亡有關(guān)；mRNA 靶向上調(diào)的lncRNA 主要富集于ErbB 和mTOR 信號通路，下調(diào)的lncRNA 靶點與運輸和代謝途徑相關(guān)，包括囊泡運輸中的SNARE 相互作用、唾液分泌、組氨酸代謝及β-丙氨酸代謝。

3 BBB模型的構(gòu)建及研究

BBB 是細菌感染腦膜炎前的最后一道屏障，它主要由腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和周皮細胞構(gòu)成。hBMECs 通過表面的緊密連接蛋白組成了BBB 的主體結(jié)構(gòu)。小膠質(zhì)細胞在外與周皮細胞、星形膠質(zhì)細胞共同構(gòu)成BBB的免疫細胞群。

3.1 緊密連接蛋白

通過對PCN033 感染小鼠和hBMECs 的體內(nèi)體外研究發(fā)現(xiàn)，ExPEC 感染鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子（Snail-1）缺失的hBMECs，細胞表面緊密連接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-5、β-catenin 均發(fā)生顯著下調(diào)，表明Snail-1調(diào)控了上述蛋白的表達［11］。

3.2 細胞骨架蛋白

肌動蛋白絲是由雙鏈蛋白集合而成的高度組織化的結(jié)構(gòu)單元，包括肌動蛋白束、肌動蛋白網(wǎng)狀物、皮質(zhì)肌動蛋白微絲和膜表面的細胞骨架蛋白，這些結(jié)構(gòu)通過微管、微絲和中間絲纖維結(jié)合形成細胞骨架。研究發(fā)現(xiàn)hBMECs感染PCN033后，激活了表皮生長因子受體（EGFR），其相關(guān)配體HB-EGF被激活，活化的EGFR 與ErbB3 形成二聚體，競爭性地從細胞內(nèi)的F -actin 招募和分解ACTN4，導(dǎo)致宿主細胞肌動蛋白細胞骨架重排，最終促使細菌入侵［12］。

3.3 通透性

目前檢測細菌突破BBB 的方法主要包括細胞體外共培養(yǎng)模型［13］、腦部載菌量檢測［11］和染料滲透性檢測［11］3 種方法，通過相互驗證判斷細菌感染是否突破BBB。

4 PCN033致細菌性腦膜炎免疫機制研究

PCN033 成功穿透BBB 在體內(nèi)形成菌血癥，完成對hBMECs的侵襲，在此過程中PCN033通過細胞穿透血屏障而不改變hBMECs 單層的完整性，通過特定的宿主細胞因子和細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)腦膜炎的發(fā)生，其潛在機制仍不明晰［14］。

研究發(fā)現(xiàn)，PCN033 感染hBMECs 后，hBMECs 表面多個重要蛋白、lncRNA 的表達發(fā)生了改變，細胞內(nèi)信號通路被激活，從而介導(dǎo)神經(jīng)炎癥的發(fā)生。PCN033 感染hBMECs 后，誘導(dǎo)腦微血管內(nèi)皮血管生成素樣4（ANGPTL4）高表達，通過激活A(yù)RHGAP5/RhoA/MYL5信號通路，增加MYL5的表達，破壞BBB功能［13］；Yang 等［11］發(fā)現(xiàn)，PCN033 感染誘導(dǎo)VEGFA和Snail-1 的上調(diào)，并由此激活TLR2-MAPK-ERK1/2 信號通路，感染反應(yīng)中促炎細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生也促進了VEGFA 和Snail-1 的上調(diào)，從而進一步介導(dǎo)了BBB 的破壞；Yang 等［15］發(fā)現(xiàn)ICAM-1 的上調(diào)有助于中性粒細胞或單核細胞募集，以及腦膜炎大腸桿菌感染后的神經(jīng)炎癥破壞；Amjad 等［16］發(fā)現(xiàn)，PCN033 感 染hBMECs 后，miR-19b-3p 顯著下調(diào)，從而通過增加NF-κB 信號的負調(diào)控因子TNFAIP3 的表達來降低促炎細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生。

5 小結(jié)

目前，PCN033 的致病機制在研究中不斷被發(fā)掘，研究主要集中在細菌的毒力因子的作用和相互作用的細胞表面蛋白和重要轉(zhuǎn)錄因子。近年來，關(guān)于ncRNAs 的功能報道也逐漸增多，其在病原菌致病的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮著直接或者間接的調(diào)控作用；進一步探究ExPEC 感染過程中circRNAs 的調(diào)控機制，也有助于加深對CNS 感染性疾病的理解。了解Ex-PEC 與宿主相互作用機制，也有助于預(yù)防和治療由ExPEC導(dǎo)致的腦膜炎。