朱玉華，朱 琳，劉文娟，劉緒同，魏可健

（深圳市金新農(nóng)科技股份有限公司，廣東 深圳 518107）

仔豬飼養(yǎng)是養(yǎng)豬生產(chǎn)中的關鍵環(huán)節(jié)，斷奶后仔豬腹瀉是危害仔豬生產(chǎn)最重要的疾病之一，嚴重影響仔豬后期生長發(fā)育和養(yǎng)殖效益。在飼料中添加高劑量氧化鋅和抗生素是防止腸道感染、防治斷奶仔豬腹瀉和抗病促生長的傳統(tǒng)手段。隨著濫用抗生素帶來的細菌耐藥性增強、藥物殘留引起食品安全等問題日益突出，根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告，2020 年7 月1 日起，已全面禁止飼料中促生長類藥物飼料添加劑使用。一些欄舍條件、養(yǎng)殖技術較差的用戶可能無法適應無抗飼料，另外替抗技術不可避免會增加一定的成本，因此研發(fā)高效低成本的抗生素替代產(chǎn)品、降低無抗飼料成本、保障養(yǎng)殖效益依然是研究的重點。益生菌、微生態(tài)制劑及抗菌肽等具有調節(jié)腸道菌群、抑制有害微生物生長、促進豬只采食和生長、提高機體免疫機能等特點，作為新型抗生素替代品具有良好的應用前景。

1 斷奶仔豬腸道健康研究現(xiàn)狀

腸道黏膜屏障結構和功能的完整性是其發(fā)揮消化、吸收和免疫防御等生理功能的基礎，斷奶應激引起的腸道菌群紊亂和屏障損傷是導致仔豬腹瀉、生長受阻甚至死亡的重要原因。仔豬斷奶時會受到飼料改變、心理應激和環(huán)境應激等3 方面因素的干擾［1］，進而造成腸道生理結構和功能、免疫功能及腸道菌群結構的改變。近年來，腸道菌群在仔豬腹瀉發(fā)生中的作用受到越來越多的關注。由于全面禁止飼料中添加抗生素，以腸道菌群為靶點尋找新的綠色生物飼料和添加劑防治仔豬腹瀉、促進仔豬腸道健康和生長，倡導綠色無抗養(yǎng)殖理念對于養(yǎng)豬生產(chǎn)和人類食品安全都至關重要［2］。微生態(tài)制劑以及發(fā)酵代謝物、酶制劑、抗菌肽、有機微量礦物質飼料添加劑等替代抗生素在添加劑預混合飼料中的應用也越來越廣泛［3-7］。

仔豬在斷奶窗口期生長發(fā)育及生理機能尚不完善，主要包括：消化系統(tǒng)發(fā)育和功能不完善、胃容積小且消化機能不足、免疫系統(tǒng)發(fā)育和功能不完善。斷奶意味著仔豬的胃腸生理、微生物及免疫發(fā)生著巨大的變化。斷奶后由于日糧形態(tài)改變造成消化道pH升高，有益菌如乳酸菌及雙歧桿菌等含量下降，有害菌如大腸桿菌等大量繁殖、釋放毒素，引發(fā)菌群平衡失調［8］。在此基礎上原發(fā)或繼發(fā)腸道屏障損傷、上皮細胞形態(tài)和功能改變，腸絨毛高度降低、隱窩深度增加等，致使仔豬消化吸收功能進一步受損［9］，而仔豬自身免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不完善［10］，抗病力差，極易出現(xiàn)生長停滯、精神萎靡、腹瀉等斷奶應激綜合征。腸道結構和功能的損傷，會極大減少腸道分泌型免疫球蛋白A（Secretory immunoglobulin A，sIgA），直接黏附腸道黏膜的有害菌增加、釋放毒素，形成腸道損傷的惡性循環(huán)［11］。此外，大量研究表明，斷奶仔豬體內磷酸化酶活性降低，糖異生能力較差，碳水化合物等能源物質的利用受限，體脂沉積減少，對氨基酸的代謝可能存在缺陷［12-19］。斷奶仔豬的生理特點以及斷奶應激、仔豬腹瀉對生產(chǎn)效率的影響現(xiàn)狀，決定了對飼料品質、功能和飼喂方式等的特殊要求。

2 微生態(tài)制劑在飼料養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應用

微生態(tài)制劑是指采用正常微生物活菌或促進微生物生長的物質制成的生物制劑，一切能促進機體正常微生物生長或抑制致病菌生長繁殖的均可稱為微生態(tài)制劑。近年來，已研究出含菌體組分及其代謝產(chǎn)物死菌的產(chǎn)品。按照所包含的菌種類型，可將微生態(tài)制劑分為乳酸菌類、酵母菌類和芽孢桿菌類；按其所含菌種的數(shù)量和菌種組合工藝，可分為單一菌種和復合菌種微生態(tài)制劑。結合固態(tài)和液態(tài)微生物發(fā)酵工藝以及飼料營養(yǎng)等專業(yè)技術，微生態(tài)制劑已形成種類繁多、應用廣泛的一類產(chǎn)品。

2.1 微生態(tài)制劑在養(yǎng)豬生產(chǎn)中的應用和作用機制

微生態(tài)制劑具有促進動物腸道有益菌定植、維持機體微生物區(qū)系平衡、促進營養(yǎng)物質的消化和吸收及增強機體的免疫功能等優(yōu)點。在畜牧養(yǎng)殖生產(chǎn)中，益生菌制劑本身含有豐富的營養(yǎng)物質，具有調節(jié)腸胃微生態(tài)平衡的功效，且無毒無污染，不產(chǎn)生細菌耐藥性，可減緩幼齡動物斷奶應激等而備受人們的青睞［20］。已有研究發(fā)現(xiàn)，在豬日糧中添加復合微生態(tài)制劑可達到提高斷奶仔豬生長速度、防治腹瀉及母豬便秘等作用［21］。

結合微生態(tài)制劑在畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中的應用，其具有以下作用效果。

2.1.1 營養(yǎng)作用 通過微生物發(fā)酵及飼料營養(yǎng)等進行合理設計，可改善飼料風味，提高纖維、小肽等營養(yǎng)物質的消化吸收，提高飼料利用率；同時益生菌代謝可產(chǎn)生各類消化酶、有機酸和一些未知生長因子，例如芽孢桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶及纖維素酶等，利于飼料營養(yǎng)物質的進一步降解從而更易于動物機體消化吸收；此外，菌體蛋白可被動物宿主消化吸收，如酵母菌可作為優(yōu)質的單細胞蛋白原料，富含蛋白質、氨基酸和多糖，可提高飼料的適口性，進而提高動物采食量，促進動物生長性能并能夠增強機體免疫功能［22］。微生物和宿主之間進行的營養(yǎng)物質、能量和基因的交換，被稱為“三流循環(huán)學說”，即宿主為機體內微生物提供其生長所需要的營養(yǎng)物質和能量，微生物再通過自身的合成、代謝和降解，對宿主體內的營養(yǎng)物質進行再加工，實現(xiàn)循環(huán)。

2.1.2 去除飼料中抗營養(yǎng)因子 通過微生物發(fā)酵去除豆粕中的大豆抗原蛋白、棉粕中的游離棉酚等，有助于植物蛋白原料在幼齡動物階段的應用。研究表明，地衣芽孢桿菌等對霉菌毒素嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮等具有良好的降解作用；在當前飼料成本居高不下、人畜爭糧等大背景下，通過微生態(tài)制劑及發(fā)酵技術提高非常規(guī)原料的消化吸收及利用、去除抗營養(yǎng)因子，改善原料加工特性及提高適口性等方面具有很好的發(fā)展前景。

2.1.3 提高機體免疫力 大量研究表明，益生菌對動物機體具有重要的免疫調節(jié)作用，可通過調節(jié)腸道菌群區(qū)系平衡、刺激免疫物質的活性、調節(jié)免疫應答等多種途徑，加強動物機體的免疫力［15］，而且在抗菌、抗病毒及抗霉菌毒素方面效果顯著。此外，微生態(tài)制劑中死菌及代謝產(chǎn)物也具有一定的調節(jié)腸道微生物區(qū)系的作用，益生菌具有減少腸道細胞氧化損傷及發(fā)揮抗氧化功能等作用［23］。

2.1.4 抑制病原菌黏附 腸道菌群具有對外來病原微生物的定殖抗力，而益生菌進入機體腸道，可與病原體競爭腸道黏膜上有限的附殖位點，達到抵御病原微生物和條件性致病菌定殖的作用，從而保證機體健康。其作用機制主要為優(yōu)勢菌群理論，即健康動物機體腸道內的有益菌群屬于厭氧菌，具有耐酸的特性，而腸道中有害菌大部分是需氧型菌群且不耐酸［24］，乳酸菌進入動物機體腸道中可通過黏附腸黏膜進行定殖，大量定殖的乳酸菌進一步降低腸道環(huán)境的pH，達到抑制有害菌生長和定殖的作用，從而維持腸道菌群平衡和腸黏膜屏障功能［25］。

2.2 微生態(tài)制劑在養(yǎng)豬生產(chǎn)應用中存在的問題

微生態(tài)制劑具有無毒、無殘留、無耐藥性及可有效補充消化道內有益微生物等諸多優(yōu)點，在斷奶仔豬中應用可有效緩解仔豬斷奶應激和腹瀉情況［26］，提高動物機體生長性能等［27］。微生態(tài)制劑不但能提高畜產(chǎn)品質量，還能減少環(huán)境污染，但其應用效果受多方面因素的限制。目前我國從事微生態(tài)制劑的企業(yè)有上千家，市場上微生態(tài)制劑產(chǎn)品中菌株種類和含量不同，缺乏統(tǒng)一的產(chǎn)品規(guī)范和質量標準且市場推廣普及率較低，是限制微生態(tài)制劑產(chǎn)業(yè)規(guī)模的重要瓶頸。乳酸桿菌等益生菌在益生作用方面具有較好的應用潛力，然而其抗逆性差，受生產(chǎn)工藝、儲存運輸、飼喂方式和劑量等條件的影響，導致益生菌的活性嚴重降低，進入動物腸道后仍存活的益生菌種類和數(shù)量大大減少。隨著微生物研究和動物腸道健康調控觀念的普及，各類微生態(tài)制劑產(chǎn)品不斷涌出，普遍存在菌種來源不明、菌種搭配盲目組合、大規(guī)模發(fā)酵產(chǎn)品質量穩(wěn)定性差、多菌種混合發(fā)酵代謝過程不清晰、產(chǎn)品質量評價體系缺失等問題，極大地限制了益生菌等微生態(tài)制劑的應用效果。

3 動物腸道微生物研究概述

了解動物腸道微生態(tài)功能，掌握微生態(tài)對動物腸道健康的調控作用及機制，是進一步發(fā)揮微生態(tài)制劑應用效果的關鍵。在正常的生理狀態(tài)下機體腸道內的細菌無論在菌種還是在數(shù)量上均保持著動態(tài)的平衡，稱為腸道微生態(tài)平衡［28］。腸道菌群自宿主出生后便開始定殖，環(huán)境因素、飲食習慣、生活方式均可以影響腸道菌群與宿主之間的動態(tài)平衡，這種動態(tài)平衡的維持對機體生長發(fā)育、消化吸收、免疫功能等均具有重要意義。益生菌及其共生菌在腸道黏膜形成的菌膜具有十分重要的作用，不同特性的微生物族群形成優(yōu)勢菌群和酸性厭氧環(huán)境，共同形成相對穩(wěn)定的菌膜結構和生物屏障，形成腸道黏膜定殖抗力，可有效降低有害菌黏附、抵御有害菌及條件性致病菌等對機體的侵襲［29］。

3.1 腸道微生物與機體健康調控

腸道微生物參與構成機體腸道黏膜物理屏障、化學屏障和生物屏障，是機體腸黏膜屏障重要的組成部分，同時免疫激活作用產(chǎn)生IgA 和IgM 及各種免疫活性細胞和細胞因子等，有助于動物早期免疫屏障的建立［30］。腸道微生物具有促進宿主營養(yǎng)物質代謝，自身也可以代謝產(chǎn)生多種維生素、非必需氨基酸等，為自身提供養(yǎng)料的同時也為宿主提供了養(yǎng)分。腸道微生物可分解動物本身難以消化利用的植物性原料如纖維素、半纖維素等，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）。SCFAs 是后腸黏膜細胞的主要能源來源，其中乙酸、丙酸和丁酸含量最為豐富，腸細胞發(fā)揮生理功能所需約60%～70%的能量來自于丁酸，對促進腸黏膜上皮細胞的生長及生理功能的發(fā)揮具有重要作用。SCFAs作為重要的信號因子參與信號通路調節(jié)機體代謝，可通過激活SCFAs受體、釋放腸激素肽等影響腸胃蠕動，SCFAs 還可影響胃腸道黏液的分泌，維持腸黏膜上皮結構的完整，促進腸道健康［31］。

腸道菌群另一重要作用為調節(jié)機體代謝和免疫系統(tǒng)功能，在動物出生時機體內是無菌的，通過正常菌群的生長逐步刺激機體免疫球蛋白的分泌和釋放，促進免疫系統(tǒng)的發(fā)育和成熟，逐步構建機體正常的免疫機能。同時，腸道免疫系統(tǒng)持續(xù)性地調節(jié)宿主對病原菌的耐受性，調節(jié)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，二者相輔相成［32］。腸道微生物被認為是宿主主要的抗原來源物，如雙歧桿菌、干酪乳桿菌等可刺激腸黏膜細胞分泌sIgA，sIgA 是腸黏膜免疫的主要效應因子，可有效中和黏膜上皮內的病原體，激活腸黏膜免疫細胞因子與免疫應答等［32］。無菌動物是研究微生物的重要工具模型，無菌小鼠的潘氏結發(fā)育程度低，僅有極少的淋巴細胞和生發(fā)中心，在給無菌小鼠喂服雙歧桿菌后，隨著雙歧桿菌在體內定殖，小鼠潘氏結內淋巴濾泡大量增生，產(chǎn)生sIgA數(shù)量增加，腸道黏膜屏障和免疫功能趨于成熟，表明腸道菌群的建立、定殖和成熟，對機體免疫系統(tǒng)的啟動、發(fā)育成熟有著極其重要的作用［33］。腸道菌群對機體非特異性免疫和特異性免疫均有調控作用，共同形成腸道內第一道免疫屏障［34］。

3.2 腸道微生物研究在畜禽生產(chǎn)中的應用

動物腸道健康是保障動物正常生長發(fā)育的前提。隨著畜牧業(yè)實現(xiàn)現(xiàn)代化，健康養(yǎng)殖理念越來越多地受到關注，而動物腸道健康是健康養(yǎng)殖的關鍵。飼料中禁止添加抗生素后，如何維持或增強畜禽健康就成為目前研究的重點，尤其是畜禽早期的腸道健康［35］。幼齡動物腸道發(fā)育不健全，尚未建立穩(wěn)定的腸道微生物群，免疫功能發(fā)育不完全，腸道微生態(tài)平衡穩(wěn)定性非常脆弱，易受到各種因素如斷奶、環(huán)境、抗生素等的影響，導致嚴重的腸道微生態(tài)紊亂［36］。幫助幼齡動物逐步建立腸道菌群穩(wěn)態(tài)可刺激幼齡動物腸黏膜免疫器官的發(fā)育，增強機體免疫功能，抵抗外來病原菌的侵入，進而促進腸道健康和動物生長發(fā)育［37］。

在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，出生和斷奶是仔豬生長過程中最關鍵的2 個節(jié)點，初生仔豬腸道的形態(tài)結構不完善，消化吸收機能不健全，易受外界因素的干擾；斷奶窗口期仔豬遭受內外應激時會引發(fā)腹瀉［38，39］。腹瀉是涉及腸道菌群、腸道免疫生理功能、食物改變、感染等多因素的綜合性問題，利用整體的調控技術才能有效改善腹瀉。早期菌群干預對新生仔豬腸道菌群快速定殖、腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育及對斷奶仔豬腸道菌群的恢復均具有重要作用。因此，通過營養(yǎng)手段調控仔豬腸道菌群健康和免疫系統(tǒng)發(fā)育，可有效促進仔豬腸道健康。

4 基因工程生物制劑的應用與發(fā)展前景

基因工程技術是目前生物技術應用的重要組成部分，構建重組基因工程菌表達外源目的產(chǎn)物是獲取新生物制品的有效途徑，基因工程技術和發(fā)酵工程技術的有機結合，使許多非自然存在的外源蛋白或多肽得以規(guī)?；?、低成本地生產(chǎn)。用于外源基因表達的系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞、植物細胞和哺乳動物細胞等。其中微生物表達系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母和芽孢桿菌系統(tǒng)，因其生長周期短、培養(yǎng)密度大和蛋白質產(chǎn)量高等優(yōu)點被廣泛應用，是目前主要的外源蛋白表達系統(tǒng)［40］。大腸桿菌（Escherichia coli）是目前最為成熟的表達系統(tǒng)，具有生長速度快、易于培養(yǎng)等優(yōu)點。但是大腸桿菌在表達外源基因時存在蛋白加工不成熟的問題，如使酶蛋白不能發(fā)生糖基化修飾而活性較低，另外表達的重組蛋白多以包涵體的形式存在難以分泌到胞外，無法行使其正常的生理功能。酵母表達系統(tǒng)主要有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）、多形漢遜酵母（Hansenula polymorpha）和解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）等［41］。釀酒酵母具有繁殖速度快、表達水平高及可以進行蛋白加工和修飾等優(yōu)點，但其分泌效果差、表達的蛋白易無活性、表達菌株不穩(wěn)定及糖基化程度過高等缺點也限制了其應用范圍。

目前基因工程菌及其表達產(chǎn)物多停留在實驗室小試階段，鮮有生產(chǎn)應用的報道。常規(guī)發(fā)酵工藝表達效率較低、后期純化成本高，且發(fā)酵后得到的重組產(chǎn)品穩(wěn)定性評估少見報道，重組蛋白質喪失活性或其通過消化道容易被所分泌的酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶等所降解，這仍是一個急需解決的技術難題。因此，迫切需要優(yōu)化重組基因工程菌表達體系和發(fā)酵工藝。通過高密度發(fā)酵制備重組酵母菌生物制劑，大幅提高目的蛋白的產(chǎn)出率和產(chǎn)品質量，降低生產(chǎn)成本，評定其在生產(chǎn)上的應用效果，為其作為一種新的飼料添加劑積累資料，也為飼用抗生素的替代提供了一條新的解決途徑。此外，基因工程疫苗的佐劑等也是科學研究與產(chǎn)業(yè)化應用的重要方向。

5 小結

隨著抗生素濫用，畜禽生物安全、環(huán)境污染和食品安全問題日趨嚴峻，倡導綠色無抗養(yǎng)殖理念對于養(yǎng)豬生產(chǎn)和人類食品安全都至關重要。斷奶仔豬腹瀉對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，其發(fā)病涉及腸道菌群、腸道生理、免疫功能、營養(yǎng)狀況及感染等多種因素，其中腸道菌群對仔豬腹瀉發(fā)揮著極其重要的作用，以腸道菌群為靶點尋找新的綠色生物飼料和添加劑防治仔豬腹瀉、促進仔豬腸道健康和生長是目前研究的重要方向。通過研究不同益生菌、代謝產(chǎn)物及其組合物的生物學功能和作用機制，有助于開發(fā)促進豬只生長、提高機體免疫力，調控腸道菌群、替代抗生素的高效安全的一系列新型生物制劑。了解正常菌群和動物免疫的相互關系，研制促進菌群平衡和機體免疫機能的微生態(tài)制劑或其他添加劑產(chǎn)品，對于養(yǎng)豬生產(chǎn)中減少抗生素使用、提高豬只生長和機體免疫力、促進綠色安全高效的健康養(yǎng)殖具有重要意義。

在非洲豬瘟疫情的常態(tài)化背景下，提高豬只免疫力、促進豬群健康是防控非瘟的重要環(huán)節(jié)。集約化養(yǎng)殖使疾病容易交叉感染，細菌耐藥性日趨嚴重，多種病原的混合感染愈發(fā)普遍等是當前規(guī)?；B(yǎng)殖主要存在的問題，免疫減弱和抑制是動物感染和死亡的主要原因。在飼料中增加一些功能性添加劑產(chǎn)品，不僅能促進腸道消化吸收、增進腸道健康、提高機體免疫功能，還具有減少抗菌保健用藥、改善養(yǎng)殖環(huán)境、降低腹瀉、降低氨氣含量等作用；飼料微生物技術和發(fā)酵技術已成為解決原料緊缺、替代飼用抗生素的關鍵技術，對于健康養(yǎng)殖、食品安全、環(huán)保減排等均有積極作用。目前國內微生物飼料添加劑的市場容量在180億～200億元，市場推廣普及率僅為約10%，前景十分廣闊，但也存在基礎技術積累薄弱、菌種種類與性能單一、加工工藝粗放、產(chǎn)品質量與功效參差不齊等現(xiàn)象。微生態(tài)生物制劑未來發(fā)展趨勢在于：①篩選更多具有直接促生長作用的優(yōu)良微生物，利用生物工程技術改造菌群遺傳基因，選育優(yōu)良菌種，使其具有抗酸、抗熱等能力。②加強微生物飼料添加劑菌體濃縮、穩(wěn)定工藝及菌體劑型的研究，提高活菌濃度及其對不良環(huán)境的耐受力，以提高生產(chǎn)效率及產(chǎn)品穩(wěn)定性。③微生物飼料添加劑菌種及其代謝產(chǎn)物功能研究，以篩選高酶活、產(chǎn)酸能力強、抑制病原菌能力強、抗逆性強、生產(chǎn)性能高的菌株，復合菌體現(xiàn)協(xié)同、疊加和附加值效應，并且需要重視動物消化道生理變化與微生態(tài)區(qū)系平衡。