曹烙文，李 華，黃 豆，岑延相，吳曼曼，麥澤彬，李 磊，周 振，高 偉,4

（1.暨南大學(xué) 質(zhì)譜儀器與大氣環(huán)境研究所，廣州510632；2.廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州510663；3.廣州禾信儀器股份有限公司，廣州510530；4.廣東省大氣污染在線源解析系統(tǒng)工程技術(shù)研究中心，廣州510632)

陳皮（Citri Reticulatae Pericarpium，CRP），為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥成熟果皮[1]。陳皮分為“陳皮”和“廣陳皮” ，而廣陳皮又以新會(huì)陳皮為佳品。新會(huì)陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，是中國(guó)國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品。 陳皮中的化學(xué)成分主要包括黃酮類成分、檸檬苦素類、生物堿類及揮發(fā)油類等[2-4]，其中，藥效的主要貢獻(xiàn)成分是黃酮類化合物和揮發(fā)油成分。 陳皮藥用價(jià)值高，其作為常用中藥和膳食材料具有悠久歷史，地道新會(huì)陳皮較其他地區(qū)陳皮具有更高價(jià)值，市場(chǎng)上常出現(xiàn)以次充好、以假充真等現(xiàn)象。 因此，建立一套可靠的鑒別方法，對(duì)新會(huì)陳皮的質(zhì)量評(píng)價(jià)和維持藥材市場(chǎng)秩序都具有切實(shí)的社會(huì)意義。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，新會(huì)陳皮的鑒別方法有藥材性外表鑒別[5]、薄層色譜（thin-layer chromatography,TLC）[6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法 （gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）[7-8]、 高效液相色譜 （high-performance liquid chromatography,HPLC）[9]、DNA 條碼技術(shù)[10]和近紅外光譜 （near infrared spectrum instrument,NIRS）[11]等方法。ZHENG 等[7]利用HS/SPME-GC-MS 結(jié)合多元化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)廣陳皮和陳皮進(jìn)行鑒別分析，兩類陳皮共檢出51 種揮發(fā)性組分，其中廣陳皮定性出21 種組分，并得到大牛兒烯D 等7 種廣陳皮的潛在標(biāo)志物；胡繼藤等[12]利用GC-MS 法結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)新會(huì)茶枝柑、大紅袍和溫州蜜柑3 種陳皮進(jìn)行鑒別分析，得到3 種陳皮中9 種主要共有成分，并利用主成分分析(PCA)、聚類分析和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型將3 種陳皮區(qū)分開，達(dá)到鑒別的目的。 目前，應(yīng)用最廣泛的鑒別方法是一維氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，但普遍存在分離能力不足與靈敏度低的問題，并常伴隨組分共流出與匹配度低的現(xiàn)象，導(dǎo)致檢出并定性的化合物數(shù)量和信息十分有限。因此，對(duì)于成分復(fù)雜的天然物質(zhì)的揮發(fā)性組分，需要分離分析更高效的方法。

近年發(fā)展起來的全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜（GC×GC-TOFMS）[13]分析技術(shù)通過調(diào)制器將兩根極性不同的柱子相連接，可實(shí)現(xiàn)不同沸點(diǎn)和不同極性組分的近正交分離，解決了傳統(tǒng)氣相色譜技術(shù)峰容量不足的問題。同時(shí)，飛行時(shí)間質(zhì)譜優(yōu)異的超高速數(shù)據(jù)采集性能進(jìn)一步確保毫秒級(jí)超窄全二維氣相色譜峰的檢測(cè)，并利用質(zhì)譜信息進(jìn)行精確定性識(shí)別化合物，具有分辨率高、靈敏度高、峰容量大、定性能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，逐漸應(yīng)用于食品和中藥材的化學(xué)成分分析和摻偽鑒定[14]。 QIN 等[15]利用GC×GC-TOFMS 對(duì)自貢陳皮進(jìn)行檢測(cè)，共定性出167 種化合物，同時(shí)驗(yàn)證了該方法能顯著分離一維色譜中的共流出組分。 通常，陳皮中的揮發(fā)性成分提前采用超臨界CO2萃取法、水蒸氣蒸餾法、同時(shí)蒸餾萃取法和固相微萃取法等方法[18-23]。 頂空固相微萃取(HS/SPME)技術(shù)[17]是基于固相萃取技術(shù)發(fā)展起來的集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的新一代前處理技術(shù)。 與傳統(tǒng)方法相比，HS/SPME 不僅省時(shí)省力，而且在處理過程中不會(huì)造成陳皮部分揮發(fā)性成分損失或分解變化，實(shí)現(xiàn)樣品揮發(fā)性組分的無損提取[24]。

本研究結(jié)合HS/SPME 與GC×GC-TOFMS 的優(yōu)點(diǎn)建立聯(lián)用方法， 對(duì)陳皮的揮發(fā)性成分進(jìn)行全組分精細(xì)分析，并采用多元統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，研究新會(huì)陳皮與其他產(chǎn)地陳皮的差異性，以期建立一種全新的新會(huì)陳皮鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

陳皮樣品均由廣東省藥品檢驗(yàn)所提供，樣品來自廣東新會(huì)及其他地區(qū)，包括8 個(gè)品種，共31 個(gè)樣品，詳見表1。 C7-C40 正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mg·L-1，美國(guó)Sigma-Aldrich 公司）。

表1 陳皮樣品來源信息表Table 1 The sample source information of CRP

1.2 儀器與設(shè)備

主要儀器設(shè)備：GGT 0620 型全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（廣州禾信儀器股份有限公司）、全自動(dòng)多功能在線前處理進(jìn)樣（瑞士CTC 公司）、DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭（50/30μm，美國(guó)Supeclo 公司）、多功能粉碎機(jī)（武義海納電器有限公司）。

1.3 樣品前處理與分析

取5g 陳皮樣品置于粉碎機(jī)中粉碎，準(zhǔn)確稱取1．00（±0．01）g 于20mL 頂空瓶。頂空萃取條件：樣品分析萃取前老化溫度為250℃，老化時(shí)間為15min，孵化溫度為60℃，孵化時(shí)間為15min，振搖速度為450r·min-1，萃取溫度為60℃，萃取時(shí)間為30min，解析時(shí)間為300s，解析溫度為250℃。 樣品頂空萃取進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析：氣相色譜進(jìn)樣口溫度250℃，分流比為20:1，一維色譜柱：DB-5ms（30m×0．25mm×0．25μm）；二維色譜柱：DB-17ms（1．1m×0．18mm×0．18μm）；升溫程序：40℃保持3min，以4℃·min-1升溫到230℃，保持5min，載氣(氦氣)流速1mL·min-1；調(diào)制器條件采用固態(tài)熱調(diào)制器，選擇HV 調(diào)制柱（1．1m×0．25mm），調(diào)制周期為4s；質(zhì)譜檢測(cè)條件：電子轟擊離子源（EI 源）燈絲發(fā)射電流200μA，電離能70eV；離子源溫度230℃，接口溫度250℃；檢測(cè)器電壓-1750V；采集質(zhì)量范圍40～500u，采集速度100 譜·s-1，溶劑延遲2min。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用全二維數(shù)據(jù)處理工作站軟件Canvas 對(duì)信噪比大于10 的峰自動(dòng)識(shí)別， 對(duì)每個(gè)化合物的質(zhì)譜圖進(jìn)行譜庫（NIST 17）檢索，C7-C40 正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)溶液（10mg·L-1）進(jìn)行保留指數(shù)（retention index，RI）測(cè)定。結(jié)合質(zhì)譜信息與保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法自動(dòng)生成各成分的相對(duì)含量。利用Simca 14．1 對(duì)揮發(fā)性組分進(jìn)行主成分分析法（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）分析，找到新會(huì)陳皮與其他產(chǎn)地陳皮的差異性化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 新會(huì)陳皮的揮發(fā)性成分分析

由圖1 可知，在19．8min 處僅能觀測(cè)到1 個(gè)色譜峰，提示只檢測(cè)出1 種成分。然而，采樣全二維氣質(zhì)分析可以發(fā)現(xiàn)在相同的保留時(shí)間處（19．8min）觀測(cè)到2 種物質(zhì)（圖1），并獲得2 個(gè)不同的質(zhì)譜圖（圖2）。 進(jìn)一步通過NSIT 數(shù)據(jù)庫匹配鑒定出2 種成分：α,α,4-三甲基-苯甲醇和反式-p-薄荷-1(7),8-二烯-2-醇兩個(gè)化合物，兩者的正反匹配度均接近900，RI 與NIST-RI 相差±5，說明定性結(jié)果可靠。 因此，相較于傳統(tǒng)的一維氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用，全二維氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用能更好地對(duì)陳皮進(jìn)行全組分的精細(xì)分析。

圖1 α,α,4-三甲基-苯甲醇和反式-p-薄荷-1(7),8-二烯-2-醇的一維色譜圖和二維色譜圖對(duì)比Figure 1 Dynamic trend diagram of seedlings growth under different exogenous light sources

圖2 α,α,4-三甲基-苯甲醇（圖A）和反式-p-薄荷-1(7),8-二烯-2-醇（圖B）的質(zhì)譜圖Figure 2 The mass spectrogram of benzenemethylol, α, α, 4-rimethyl- (A) and trans-p-mentha-1(7),8-dien-2-ol(B)

采用HS/SPME-GC×GC-TOFMS 對(duì)陳皮樣品進(jìn)行分析，每個(gè)陳皮樣品檢測(cè)到約500 個(gè)組分，按以下條件對(duì)陳皮樣品的揮發(fā)性組分進(jìn)行篩選：（1）在NIST17 中的正反匹配度均大于800；（2）峰面積相對(duì)含量超過0．001%；（3）在同種類樣品中均被檢出，篩選后得到每個(gè)樣品組分約為150 個(gè)。 3 種新會(huì)陳皮的二維色譜輪廓圖如圖3，根據(jù)化合物的色譜圖信息和定性結(jié)果可知，3 種新會(huì)陳皮的揮發(fā)性組分較為相似，將3 種新會(huì)陳皮的化合物進(jìn)行匯總分析得到102 種共有化合物(表2)。 由表2 可知，3 種新會(huì)陳皮共有揮發(fā)性組分主要包括萜類化合物及其含氧衍生物（39 種）、醇類化合物（22 種）、醛類化合物（12 種）、酮類化合物（7 種）、烯烴化合物（7 種）和酯類化合物（5 種）等，這些揮發(fā)性組分共同作用形成了新會(huì)陳皮的主要香氣特征，也與以往文獻(xiàn)曾報(bào)道過的陳皮中主要揮發(fā)性成分相吻合[25]。 新會(huì)陳皮揮發(fā)性成分中含量較大的組分為對(duì)傘花烴 （8．18%～15．64%）、 檸檬烯（5．56%～12．07%）和α-蒎烯（5．56%～12．07%）。在醫(yī)藥領(lǐng)域中，對(duì)傘花烴可用于制作祛痰[26]、止咳、平咳藥物[27]；檸檬烯具有鎮(zhèn)咳、祛痰和抗菌等作用[28]，在臨床上被用來作為治療膽囊炎的藥物[29]；而α-蒎烯也具有明顯的鎮(zhèn)咳和祛痰作用[30]；這些結(jié)果說明揮發(fā)性成分確實(shí)對(duì)陳皮燥濕化痰的藥理效果有貢獻(xiàn)作用。

表2 3 種新會(huì)陳皮共有組分Table 2 The common components of three kinds of Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

圖3 3 種新會(huì)陳皮的二維色譜輪廓圖Figure 3 Chromatogram of three kinds of Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium

2.2 陳皮揮發(fā)性成分的PCA 分析

PCA 是一種無監(jiān)督的多變量統(tǒng)計(jì)方法，能在最大程度保留數(shù)據(jù)原始信息的基礎(chǔ)上對(duì)樣品加以區(qū)分[31]。 將8種陳皮的揮發(fā)性組分進(jìn)行PCA 分析，得分如圖4。前5 個(gè)主成分的方差貢獻(xiàn)率為79．5%。從得分圖可看出，欽州陳皮和揭陽陳皮與其余陳皮區(qū)別明顯，新會(huì)陳皮、乳源陳皮及桂林陳皮則分布十分接近，不能明顯區(qū)分，推斷與其品種相似有關(guān)。

2.3 陳皮揮發(fā)性成分的OPLS-DA 分析

試驗(yàn)進(jìn)一步地采用OPLS-DA 分析尋找新會(huì)陳皮差異性標(biāo)志物。OPLS-DA 是一種有監(jiān)督的多元統(tǒng)計(jì)方法，能夠傾向于提取利于樣本分類的變量信息，這在很大程度上降低了系統(tǒng)噪聲干擾，進(jìn)而提高分類效能[32]。 將8種陳皮樣品的揮發(fā)性組分進(jìn)行OPLS-DA 分析，將3 種新會(huì)陳皮歸類為“新會(huì)INHUI”， 余下5 種陳皮歸類為“其他OTHERS”。 由圖5A 可知，新會(huì)陳皮與其他陳皮得到明顯區(qū)分。 該模型下R2Y(cum)和Q2(cum)分別為0．995 和0．991， 驗(yàn)證模型 時(shí)R2 和Q2 的 截 距 分 別 為0．12 和0．52（圖5B），說明模型穩(wěn)健可靠?？衫肙PLSDA 中的S-plot 圖以及VIP 值進(jìn)行差異化合物的識(shí)別[33]。由圖5C 可知，S 型曲線上的每一個(gè)點(diǎn)代表1 個(gè)化合物，縱坐標(biāo)表示關(guān)聯(lián)性，橫坐標(biāo)表示方差，選取|p(corr)|＞0．5和|p|＞0．1 且VIP 值大于2 作為篩選條件， 得到13 種潛在差異化合物，這些差異化合物在陳皮樣品中的相對(duì)含量見表3。結(jié)果顯示，薄荷烯酮僅在“新會(huì)XINHUI”陳皮中被檢出。 因此，薄荷烯酮很有可能是區(qū)分新會(huì)陳皮標(biāo)志物，這為新會(huì)陳皮的鑒別提供新的科學(xué)依據(jù)。

圖4 8 種陳皮揮發(fā)性組分的主成分分析得分圖Figure 4 PCA score plot of volatile components of eight kinds of Citri Reticulatae Pericarpium

圖5 OPLS-DA 的得分圖(A)、置換驗(yàn)證圖(B)和S 圖（C）Figure 5 Score plot (A)， Permutation plot(B) and S-plot (C) of OPLS-DA

3 討論與結(jié)論

本研究采用HS/SPME-GC×GC-TOFMS 對(duì)5 個(gè)產(chǎn)地共8 種陳皮的揮發(fā)性組分進(jìn)行分析鑒別，其中單個(gè)樣品檢測(cè)到化合物約500 種，體現(xiàn)出全二維氣質(zhì)聯(lián)用強(qiáng)大的分離和檢測(cè)能力。通過一定條件篩選得到新會(huì)陳皮中的102 種共有組分，主要包括萜類化合物及其含氧衍生物（39 種）、醇類化合物（22 種）、醛類化合物（12 種）、酮類化合物（7 種）、烯烴化合物（7 種）和酯類化合物（5 種）等，這些化合物共同形成了新會(huì)陳皮獨(dú)特的香氣特征和藥理作用。利用主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法（OPLS-DA）進(jìn)一步分析，通過OPLS-DA 模型，達(dá)到鑒別新會(huì)陳皮與其他陳皮的目的，并得到新會(huì)陳皮與其他陳皮的13 個(gè)潛在差異性化合物，而薄荷烯酮僅在新會(huì)陳皮中被檢出，說明薄荷烯酮很有可能是新會(huì)陳皮特有的標(biāo)志物，但這一結(jié)論仍需繼續(xù)深入研究并進(jìn)一步驗(yàn)證。試驗(yàn)結(jié)果表明，HS/SPME-GC×GC-TOFMS 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法對(duì)新會(huì)陳皮進(jìn)行鑒別是可行的， 這可為深入研究陳皮的化學(xué)性質(zhì)提供更全面的科學(xué)依據(jù)，對(duì)識(shí)別陳皮品種、鑒別新會(huì)陳皮具有一定的參考價(jià)值。

表3 新會(huì)陳皮與其他陳皮中具有明顯差異的化合物Table 3 Compounds with differences between Xinhui Citri Reticulatae Pericarpium and others