吳孟霏，李春玲，任 河，孫玉琦

（錦州醫(yī)科大學 藥學院，遼寧 錦州121001）

紅花為菊科植物紅花（Carthamus tinctorius L．）的干燥花，是傳統(tǒng)的活血化瘀中藥，具有活血通經(jīng)，散瘀止痛之功效[1]。 已有研究證明，羥基紅花黃色素A(SY)是紅花的有效成分，具有抗氧化，抑制血小板聚集，改善心肌供血，抑制血栓形成等功效[2]。 近年來我國許多地方大面積種植紅花，其中新疆因其獨特的環(huán)境成為紅花主要產(chǎn)地。由于產(chǎn)地和其他因素的不同，使得不同產(chǎn)地紅花的質(zhì)量存在差異。目前《中國藥典》（2020 版）規(guī)定以紅花中SY 含量來作為評價紅花藥材質(zhì)量的標準[3]。中藥指紋圖譜是指某些中藥材或中藥制劑經(jīng)適當處理后，采用一定的分析手段，得到的能夠標示其化學特征的色譜圖或光譜圖，它將能較為全面地反映中藥中所含化學成分的種類與數(shù)量，同SY 的含量測定相結(jié)合，能更好的對中藥質(zhì)量進行整體描述和評價。 目前，從紅花中分離出200多種化合物，包括多炔類、黃酮、甾體類、醌式查爾酮苷類、倍半萜類，其中很多的黃酮類和醌式查爾酮苷類成分已報道具有抗氧化和清除自由基的活性[4]。DPPH 法測定紅花藥材清除自由基、抗氧化的基理是二苯基苦味肼基自由基[DPPH·]是一種穩(wěn)定的以氮原子為中心的自由基，最大吸收在515 nm 波長[5]。 [DPPH·]乙醇溶液呈紫色，其濃度與吸光度呈線性關系。 在[DPPH·]乙醇溶液中加入紅花抗氧化提取物后，紅花抗氧化提取物可以與[DPPH·]自由基結(jié)合或發(fā)生替代，使[DPPH·]自由基數(shù)量減少，溶液顏色變淺，表現(xiàn)為：其在515 nm 波長處的吸光度不斷減小，直至達到穩(wěn)定。 因此，可以通過在515 nm 波長處檢測紅花抗氧化提取物對[DPPH·]自由基的清除效果，考察其抗氧化活性。

本研究通過高效液相色譜法（HPLC)，對新疆塔城、新疆伊犁、新疆烏魯木齊、新疆吉木薩爾、新疆哈密、新疆伊寧、新疆昌吉、新疆阿克蘇、四川簡陽市、云南大理、河南省開封市、陜西寶雞、內(nèi)蒙古包頭、浙江東陽、甘肅蘭州15 個不同產(chǎn)地紅花藥材中SY 含量進行測定，進行指紋圖譜研究及紅花抗氧化活性差異的考察。

1 材料與方法

1.1 材料

供試15 個產(chǎn)地紅花分別來自新疆塔城、伊犁、烏魯木齊、吉木薩爾、哈密、伊寧、昌吉、阿克蘇，四川簡陽市，云南大理，河南開封，陜西寶雞，內(nèi)蒙古包頭，浙江東陽和甘肅蘭州。 供試羥基紅花黃色素A 對照品為中國食品藥品檢定研究院提供，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼和維生素C 購自美國Sigma 公司。 甲醇、乙醇、乙腈、磷酸均為色譜純（天津市科密歐化學試劑有限公司)，水為超純水。

試驗采用的儀器有：超聲波清洗機（東莞康士潔超聲波科技有限公司）、Agilent1100 高效液相色譜儀（日立公司）、UV-2550 型UV-Vis 分光光度計(日本島津公司)、RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)、AL-204型電子天平(上海儀器廠）和中藥粉碎機（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 羥基紅花黃色素A 的含量測定 羥基紅花黃色素A 對照品溶液配制： 稱取羥基紅花黃色素A 對照品6．5mg，溶解在25%甲醇溶液中，使其濃度為0．13mg·mL-1，即得SY 對照品溶液[6]。 供試樣品羥基紅花黃色素A溶液的提?。悍Q取供試15 個不同產(chǎn)地紅花藥材粉末各0．40g，加入50%乙醇10mL，密閉環(huán)境保存24h 后，50℃超聲提取30min，濾過，提取液過0．45μm 微孔濾膜濾備用。

色譜條件：Alltech Alltima-C18 色譜柱(4．6mm×250mm，5μm)； 流動相為甲醇-乙腈-0．7%磷酸溶液 （26∶2∶72），檢測波長403nm；流速為1mL·min-1；柱溫為30 ℃；進樣量為10μL。

將供試品溶液和對照品溶液按上述色譜條件進行測定，記錄峰面積，根據(jù)式（1）計算15 個不同產(chǎn)地紅花羥基紅花黃色素A 含量。

式中：Cx為供試品濃度；CR為對照品濃度；Ax為供試品峰面積；AR為對照品峰面積。

1.2.2 指紋圖譜的建立 色譜條件:Alltech Alltima-C18色譜柱(4．6mm×250mm，5μm)，流動相為乙腈(A)-0．5%磷酸水溶液(B)；梯度洗脫程序見表1，運行時間60min，流速為1mL·min-1， 檢測波長為265nm；柱溫為30℃；進樣量10μL[7]。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.2.3 指紋圖譜的建立方法及相似度評價 將所得HPLC 圖譜依次導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004A 版”軟件，對其峰數(shù)、峰面積和保留時間等相關參數(shù)進行分析。通過軟件中的“相似度計算”功能進行供試品色譜圖譜與對照圖譜的相似度評價[8]。

1.2.4 紅花的抗氧化性

1.2.4.1 提取溶劑的篩選 稱取新疆塔城紅花藥材粉末3 份，各2g，分別以50%甲醇，50%乙醇和50%丙酮超聲振蕩提取20min，減壓濃縮至干，用無水乙醇溶解，定容于5mL 棕色瓶中，4℃保存，備用。

1.2.4.2 DPPH 自由基清除能力標準曲線的繪制 稱取2．5mg[DPPH·]加無水乙醇定容至100mL 容量瓶中，搖勻，備用。 將適量VC 溶解于無水乙醇中，配制成0．1，0．2，0．3，0．4，0．5mmoL·L-1VC 乙醇溶液。 將3．9mL[DPPH·]反應液和0．1mL 的一系列VC 乙醇溶液混合，37℃下保存10min，采用紫外可見分光光度法于515nm 處測定吸光度，根據(jù)式（2）計算清除率K[9-10]。 以VC 的濃度為橫坐標(X)，清除率為縱坐標(Y)進行線性回歸，得標準曲線：Y=0．601X+0．0411，R2=0．9975，在0．1～0．5mmoL·L-1范圍內(nèi)線性關系良好。

1.2.4.3 提取溶劑的確定 取[DPPH·]反應液3．9mL，分別與3 種不同溶劑的新疆塔城紅花藥材提取物的不同體積（10～70μL)的供試品混合，無水乙醇補足至4mL 到EP 管中，37 ℃下保溫10min，采用紫外可見分光光度法于515 nm 波長處測定吸光度，按式（2）計算清除率，測定VC 含量。 根據(jù)加入樣品體積V（μL）與清除率K（%）的關系，以加入供試品的體積（10，20，30，40，50，60，70，80μL）為橫坐標，清除率K（%）為縱坐標繪制曲線。

1.2.4.4 抗氧化活性測定 取各產(chǎn)地紅花抗氧化成分提取物0．1mL 至EP 管中，加入[DPPH·]反應液3．9mL，37℃下保存10min，采用紫外可見分光光度法于515nm 波長處測定吸光度，按式（2）計算清除率，測定維生素C含量（VCEAC)。

2 結(jié)果與分析

表2 不同產(chǎn)地紅花的含量Table 2 Content of safflower from different origins

2.1 不同產(chǎn)地紅花羥基紅花黃色素A 的含量

不同產(chǎn)地紅花藥材SY 的含量見表2， 甘肅蘭州和陜西寶雞紅花藥材不符合2020 版中國藥典規(guī)定。 四川簡陽和云南大理產(chǎn)的紅花SY 含量最高，超過3%。

2.2 指紋圖譜的建立及相似度評價

15 個不同產(chǎn)地紅花指紋圖譜見圖1；15 個不同產(chǎn)地紅花之間相似度見表3。 經(jīng)相似度軟件分析，15 個產(chǎn)地紅花藥材除新疆塔城，甘肅蘭州，陜西寶雞相似度較低外，其他產(chǎn)地紅花藥材相似度在0．9～1．0 之間，說明與標準紅花藥材存在差異。

2.3 不同產(chǎn)地紅花藥材指紋圖譜的聚類分析

由圖2 可知，15 個不同產(chǎn)地紅花藥材最終可聚成2大類，其中甘肅蘭州紅花藥材和陜西寶雞紅花藥材為一類，從含量測定結(jié)果看甘肅蘭州和陜西寶雞紅花藥材羥基紅花黃色素A 不符合藥典標準。 其他產(chǎn)地紅花藥材聚為一類，從含量測定結(jié)果看其他產(chǎn)地紅花藥材羥基紅花黃色素A 符合藥典標準。 藥典方法鑒定結(jié)果同聚類分析鑒定結(jié)果相同。15 個不同產(chǎn)地紅花藥材可被分為2類，說明產(chǎn)地對紅花質(zhì)量的綜合評價影響不大，提示紅花的質(zhì)量除了與其產(chǎn)地有關外，還與紅花生長的環(huán)境、種植的時間、放置的溫度等因素有關[11-12]。

2.4 紅花的抗氧化性

2.4.1 提取溶劑的確定 由圖3 可知，在一定的濃度范圍內(nèi)，紅花提取物的清除率均隨著提取物濃度的增加，呈現(xiàn)一定的正比例關系。紅花提取物、維生素C 對DPPH 自由基均有一定程度的抑制作用。用50%乙醇提取的新疆塔城紅花藥材的抗氧化能力相比于用50%甲醇和50%丙酮要高，所以采用50%乙醇進行紅花藥材抗氧化成分的提取。

圖1 不同產(chǎn)地紅花的指紋圖譜Figure 1 Fingerprint of safflower from different origins

表3 不同產(chǎn)地紅花相似度Table 3 Similarities of safflower from different origins

2.4.2 抗氧化活性測定 由表4 可知，不同產(chǎn)地紅花抗氧化能力依次為新疆塔城紅花＞新疆伊寧紅花＞新疆吉木薩爾紅花＞新疆阿克蘇紅花＞新疆烏魯木齊紅花＞新疆伊犁紅花＞新疆哈密紅花＞浙江東陽紅花＞新疆昌吉紅花＞內(nèi)蒙古包頭紅花＞云南大理紅花＞四川簡陽紅花＞河南開封紅花＞陜西寶雞紅花。

圖2 不同產(chǎn)地紅花聚類結(jié)果樹狀圖Figure 2 Clustering results of safflower from different origins

圖3 不同濃度供試品提取物DPPH 清除能力Figure 3 Clearance capacity DPPH different concentrations of sample extracts

表4 不同產(chǎn)地紅花清除率Table 4 Removal rate of safflower from different origin

3 討論與結(jié)論

隨著社會的發(fā)展、人們生活水平的提高、自然環(huán)境的變化，心腦血管疾病發(fā)病率呈逐年遞增趨勢，這時僅通過西藥來治療疾病有一定的局限性，這也使得人們更加關注中醫(yī)藥的治療作用，而中草藥憑借藥效穩(wěn)定、安全性高等優(yōu)點贏得中外學者的矚目[13-15]。 對于SY 的含量測定和指紋圖譜的建立，分別采用不同濃度甲醇、乙醇進行超聲提取。結(jié)果表明：乙醇提取出的產(chǎn)物相比甲醇提取出的含量相差不大，但乙醇提取的產(chǎn)物相對應的指紋圖譜的色譜峰更加清晰，不雜亂；對于乙醇濃度的選擇過高或過低均對SY 的含量產(chǎn)生影響，且與后續(xù)抗氧化實驗的提取溶劑相同，更好的對不同產(chǎn)地紅花的質(zhì)量進行監(jiān)控，故采用50%乙醇超聲提取。 本實驗選擇指紋圖譜中峰面積最大的有效成分SY 進行含量測定，研究結(jié)果表明不同來源的紅花藥材SY 的含量在0．48～32．5mg·g-1，具有較大波動，表明不同產(chǎn)地的紅花藥材質(zhì)量存在較大的差異，對于不同產(chǎn)地紅花藥材的選用還需進一步認真考察[16]。 本研究建立了SY 指紋圖譜結(jié)合有效成分含量測定的質(zhì)量評價方法，從有效成分含量的角度上更全面、準確、有效的控制紅花的質(zhì)量，保證其藥效，將為進一步體外抗氧化性，體內(nèi)藥動學、早期安全性評價等成藥效物質(zhì)基礎研究提供實驗依據(jù)[17]。

本研究考察了不同產(chǎn)地紅花藥材的抗氧化性， 通過采用50%甲醇，50%乙醇，50%丙酮對新疆塔城紅花藥材進行提取，發(fā)現(xiàn)50%乙醇提取的紅花抗氧化能力較好。 紅花藥材的抗氧化性的能力與SY 的含量大小有關，據(jù)報道，紅花中的黃酮類成分SY 和紅花黃色素B 均有抗氧化活性[18-19]。 云南紅花藥材SY 的含量高于新疆塔城紅花藥材，但其抗氧化活性不如新疆塔城紅花藥材，可能由于其中其他抗氧化成分高于新疆塔城紅花藥材，如黃酮類成分紅花黃色素B[20]。