賈春麗,路鵬霏,邱 萍,楊 穎,吳 戈,張瑞麗,毛 睿,張 華

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤中心，烏魯木齊 830000)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，全球女性中每年新發(fā)乳腺癌患者約有200萬，乳腺癌的發(fā)病率在逐年增長[1]，嚴重威脅女性健康。而在我國，每年有上萬例女性死于乳腺癌[2]。核苷三磷酸焦磷酸水解酶(NTP-PPase)可以水解核苷三磷酸(d)NTP的磷酸二酯鍵形成核苷單磷酸(d)NMP，釋放焦磷酸。NTP-PPase水解異常核苷酸明顯減少了細胞核苷酸池中的異常核苷酸，避免了DNA合成過程異常核苷酸的摻入，提高了DNA復制的準確性[3]。DCTPP1基因是NTP-PPase家族中的成員，具有NTP-PPase活性，有研究報道其為抗腫瘤藥物研發(fā)的潛在靶點[4-5]，在DNA復制過程中發(fā)揮了重要作用[6]。然而，目前對DCTPPl在臨床乳腺癌組織中的表達及功能等相關研究報道較少。本研究旨在利用腫瘤相關數據庫，明確DCTPPl在乳腺癌中的表達、分布狀態(tài)及與乳腺癌患者預后的關系，探討DCTPP1在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中所發(fā)揮的功能，為DCTPP1基因在乳腺癌中的研究奠定基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

TCGA(The Cancer Genome，Atlas http://cancergenome.nih.gov/)數據庫包括了腫瘤病例臨床基本信息，如基本資料，治療進程，臨床分期，腫瘤病理及生存狀況，包括mRNA、microRNA、Copy Number、Mutation、Protein、Methylation信息等。利用ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/)對TCGA數據庫中包括乳腺癌組織和及正常組織中的多種腫瘤組織及正常組織中DCTPP1基因mRNA的表達水平進行分析。Human Protein Reference Database是一個專門存儲人類蛋白質相互作用信息的數據庫，在該網站查詢DCTPP1基因在乳腺癌組織及正常組織中蛋白的表達狀況。

1.2 方法

1.2.1生存分析

利用基因表達譜數據動態(tài)分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)數據庫加載了TCGA數據庫中的相關數據，利用其中乳腺癌患者DCTPP1基因mRNA的表達數據分析DCTPP1基因表達水平與乳腺癌患者預后的關聯。

1.2.2病理亞型及年齡狀況

采用ualcan數據庫中存儲的TCGA 數據分析DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亞型的表達狀況。

1.2.3蛋白相互作用網絡

genemania數據庫可提供蛋白-蛋白，蛋白-DNA 和遺傳相互作用、通路、生理生化反應等信息，利用該數據庫DCTPP1蛋白參與的蛋白-蛋白，遺傳相互作用和通路、蛋白共表達網絡。

1.2.4基因功能

WebGestalt是一個基因功能富集分析的在線網站，將與DCTPP1基因相互作用的關鍵基因利用WebGestalt進行GO分析，了解其參與的細胞組分、生物過程、生物功能。

1.3 統計學處理

采用SPSS19.0軟件進行數據分析，采用Kaplan-Meier生存分析計算生存率，采用logrank檢驗估計生存率的差異，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 乳腺癌組織及正常組織中DCTPP1基因的差異性表達結果

通過ualcan網站在線分析TCGA乳腺癌患者數據庫中乳腺癌基因表達的相關信息，對比1 097例乳腺癌組織與114例正常乳腺組織中DCTPP1基因mRNA的表達水平發(fā)現，乳腺癌組織中的表達水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.01)，見圖1。

圖1 基于TCGA數據庫分析乳腺癌組織及正常乳腺組織DCTPP1基因mRNA的表達水平

2.2 DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、病理亞型的表達水平

基于ualcan數據庫進行分析，結果顯示，TNM臨床分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平顯著高于正常乳腺組織(P<0.01)，Ⅲ期乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平與Ⅰ期乳腺癌組織中該基因的表達相比明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。Luminal型乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平顯著高于正常乳腺組織(P<0.05)，HER-2過表達型、三陰型乳腺癌患者癌組織中DCTPP1基因表達水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)，見圖2。各病理亞型乳腺癌組織中DCTPP1基因表達均高于正常乳腺組織(P<0.01),其中Lumnial型乳腺癌該基因的表達明顯高于三陰型乳腺癌(P<0.01)，見圖3。

圖2 正常乳腺組織與不同分期乳腺癌組織中DCTPP1基因mRNA表達水平比較

圖3 正常乳腺組織與不同病理分型乳腺癌組織中DCTPP1基因mRNA表達水平比較

2.3 DCTPP1蛋白乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達

免疫組織化學檢測結果顯示，乳腺小葉癌組織中和乳腺導管癌組織中DCTPP1基因的表達呈現強陽性。進一步觀察乳腺癌組織中DCTPPl蛋白陽性的細胞分布格局，發(fā)現腫瘤細胞的細胞膜、細胞質及細胞核均有DCTPPl蛋白的表達，其中細胞質淺棕黃色，細胞核及細胞膜呈棕褐色。在正常乳腺組織中，DCTPPl在部分腺體細胞表達，主要位于細胞核與細胞膜，在脂肪組織中不表達，見圖4。

A、B：浸潤性癌；C、D：導管癌；E、F：正常乳腺組織。

2.4 DCTPP1基因表達水平與乳腺癌患者預后的關系

利用TCGA數據庫分析DCTPP1基因不同表達水平與乳腺癌患者預后的關聯，分析1 070例乳腺癌患者的總體生存時間，以DCTPP1基因表達的中位數為標準將患者分為DCTPP1基因高表達組(n=535)與DCTPP1基因低表達組(n=535)，分析結果表明，相對于低表達的患者，DCTPP1基因高表達降低了乳腺癌患者總體生存時間(HR=1.9,P<0.01)，見圖5。

圖5 基于TCGA數據庫中DCTPP1基因不同表達水平乳腺癌患者總體生存率分析

2.5 DCTPP1蛋白相互作用網絡預測及功能分析

genemania分析共篩選出20個DCTPP1基因相互作用蛋白質：BAP1、CAPZB、CIAPIN1、CTPS1、HERC4、LGI1、LGI2、LGI3、LGI4、MRPL21、NUBP1、PCNA、PDE12、PLK1、POLR3K、RAD23A、TSPEAR、UBQLN1、WDR74、XPNPEP1，相互作用關系包括物理相互作用、共表達、共享蛋白質結構域、共定位，見圖6。

圖6 DCTPP1基因相互作用蛋白分析

2.6 GO分析

對上述基因參與的生物學過程、細胞組分、分子功能進行分析發(fā)現，這些蛋白主要參與了代謝過程、生物調控、應激反應、細胞通信等過程。DCTPP1基因相關基因位于多種細胞成分中，包括細胞質、細胞核、囊泡、線粒體、被膜等。分子功能包括結合蛋白質、結合離子、水解酶活性、轉移酶活性、結合核苷酸、結合核酸等，見圖7。

A：生物學過程；B：細胞組分；C：分子功能。

3 討 論

世界范圍內，美國和北歐是乳腺癌高發(fā)，而亞洲地區(qū)發(fā)病率最低[7]，中國不是乳腺癌的高發(fā)國家，但由于人口基數龐大，每年女性乳腺癌新發(fā)病例的絕對數很多，位居世界第2位；每年因乳腺癌死亡的人數位列中國女性因腫瘤死亡人數的第6位[8-9]。近年來血管內皮生長因子、人表皮生長因子受體、細胞周期檢查點調節(jié)劑等靶向藥物在乳腺癌中的應用逐漸增多，然而這些靶點僅存在于部分乳腺癌患者，因此尋找乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關鍵分子或靶點，對開發(fā)新的治療乳腺癌的靶向藥物具有重要意義。

人體內的正常細胞在不斷進行自我更新，其中極為關鍵步驟是DNA復制，而該過程是細胞中是一個非常準確的過程，每代每個基因產生10-7個錯誤[10]，該過程出現差錯會導致基因發(fā)生突變，發(fā)生突變細胞中的一部分細胞就會變成前癌細胞。在人體內腫瘤微環(huán)境的作用下前癌細胞轉化為癌細胞。腫瘤細胞內異常核苷酸代謝對于腫瘤微環(huán)境的形成和維持、腫瘤細胞的增殖、凋亡和轉移等有著非常重要的作用[11]。

NTP-PPase家族在低等的原核生物和高等真核生物中都存在，該酶水解底物包括核苷三磷酸和異常核苷三磷酸[3]。NTP-PPase若缺失會導致DNA突變的增加，并影響細胞分裂。如大腸桿菌的MutT酶可以選擇性清除核苷酸池中的氧化核苷酸8-oxo-dGTP和2-OH-dATP，這一過程阻止了氧化應激導致的異常核苷酸摻入到DNA中造成的DNA損傷。在大腸桿菌中MutT的缺失導致大腸桿菌的AT-CG突變率大大增加[12]。在結核分枝桿菌中的MazG水解dUTP、2-hydroxy-dATP和8-oxo-dGTP等，該酶缺失可以造成編碼利福平抗性基因的突變明顯增多，從而影響結核分枝桿菌的正常生長[13]。因此，NTP-PPase在生物過程中不斷分解細胞代謝過程中的異常核苷酸，保證了DNA復制的準確性及生物體基因組的穩(wěn)定性。而作為被在人類細胞中發(fā)現的具有典型MazG結構域的NTP-PPase，DCTPP1基因是眾多已發(fā)現的NTP-PPase中研究報道較少的活性蛋白分子，對其酶學特性及功能研究結果提示該分子可以特異性水解dCTP和結構類似物如5-甲基-dCTP和5-鹵-DCTP[14]。

ZHANG等[4]研究多種腫瘤中DCTPP1基因的表達模式及與對應的癌旁組織之間的表達差異，與癌旁組織中的表達進行對比發(fā)現，在肺癌組織中DCTPP1基因顯著高表達，而DCTPP1基因在胃癌及結直腸癌中的表達并沒有顯著差異，同時在不同組織學亞型的腫瘤中表達狀況也不同。本研究結果顯示，DCTPP1基因在乳腺癌組織中的表達明顯高于正常乳腺組織。這與上述腫瘤中DCTPP1基因的表達模式相同。DCTPP1基因在乳腺癌不同分期、不同分子病理分型(Lumnial型、HER-2陽性過表達型、三陰型)的表達均較正常組織高，且以Lumnial型、三陰型明顯。在Human Protein Reference Database數據庫中對乳腺癌組織及正常乳腺組織采用免疫組織化學法檢測DCTPP1蛋白的表達發(fā)現，DCTPP1蛋白在乳腺導管癌及小葉癌中的表達均高于正常乳腺組織，SONG等[14]研究了161例乳腺癌組織和132例癌旁組織，免疫組織化學結果顯示DCTPP1基因在癌組織中過表達，且在細胞核中的表達濃聚，這與本課題組研究結果一致，DCTPP1基因與腫瘤密切相關。

本課題組分析1 070例乳腺癌患者的總體生存時間后發(fā)現高表達DCTPP1基因的乳腺癌患者總體生存時間明顯縮短，MORISAKI等[15]在對胃癌干細胞的蛋白組學進行比對分析后研究發(fā)現DCTPP1基因的活化轉移可能與胃癌干細胞中DNA的復制相關，并發(fā)現DCTPP1基因的高表達與胃癌患者的預后不良有關。LU等[16]在前列腺癌中也有同樣的發(fā)現，提示DCTPP1基因與乳腺癌、前列腺癌、胃癌的不良預后相關，提示DCTPP1基因可能是腫瘤患者預后不良因素。

REQUENA等[17]探究了DCTPP1基因在細胞核苷酸同源性中的作用,研究了這種酶的廣泛表征,發(fā)現該酶在細胞核、細胞質和線粒體中普遍存在,在正常細胞代謝過程中,DCTPP1基因可催化dCTP水解成dCMP，從而將dCMP池維持在胸苷酸合成的水平。dCTP/dTTP的適當比例對于維持核苷酸庫中生理穩(wěn)態(tài)十分重要。DCTPP1基因在細胞中的活性可能參與核苷酸庫中dCTP濃度的調節(jié)，影響細胞內核苷酸庫中dCTP/dTTP 的比例?，F有研究顯示NTP-PPase細胞代謝過程中的消除異常的核苷酸，發(fā)揮著“清理門戶”功能[3]。XIA等[5]隨后在對胃癌中的研究發(fā)現高表達的DCTPP1基因通過對MDRl的去甲基化作用促進了胃癌對化療的耐藥性。通過與DCTPP1基因相關的蛋白進一步探究DCTPP1基因的功能發(fā)現，此類蛋白廣泛分布于細胞各個結構中，參與細胞的代謝生長過程，蛋白結合過程。LU等[16]研究發(fā)現過表達DCTPP1基因促進前列腺癌腫瘤細胞的生長。REQUENA等[18]在對人宮頸癌細胞株Hela的研究發(fā)現DCTPP1基因可增加化療藥物的抗腫瘤活性。王佳琦等[19]研究證實雷公藤可以直接與DCTPP1基因相互作用，抑制DCTPP1基因酶的活性從而干預腫瘤的發(fā)生。

綜上所述，DCTPP1基因在乳腺癌組織中高表達，且與乳腺癌患者不良預后相關，可能參與了乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程，對該基因進一步研究可協助評估患者預后并為乳腺癌的治療提供新的干預靶點。