鄧穗燕，郭旭光，李 瑩，夏 勇△

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣州 510150；2.廣東省清遠(yuǎn)市清城區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 511500)

臨床微生物實(shí)驗(yàn)室主要依靠手工接種的方法進(jìn)行標(biāo)本前處理，手工方法的局限性在于因檢驗(yàn)人員技術(shù)水平難以統(tǒng)一，標(biāo)本處理很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作，不利于尿培養(yǎng)的后續(xù)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果解釋。臨床微生物檢驗(yàn)最大的制約因素還是在質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化方面。在國內(nèi)，最早在2006年被引入使用的是意大利Diesse公司的Robobact自動(dòng)接種培養(yǎng)系統(tǒng)，僅有3家醫(yī)院相繼使用并報(bào)道了儀器的性能[1-3]。直到近幾年，全自動(dòng)微生物標(biāo)本處理系統(tǒng)以其工作高效性在國內(nèi)迅速受到關(guān)注[4-7]。目前，全球微生物流水線系統(tǒng)只有美國BD公司和意大利Copan公司提供，梅里埃公司只有1臺(tái)Isola單機(jī)版的自動(dòng)化接種儀，且其已經(jīng)正式宣布退出在臨床微生物自動(dòng)化流水線設(shè)備上的研發(fā)和投入。2015年，BD Kiestra InoqulA作為在中國的第1臺(tái)全自動(dòng)標(biāo)本處理系統(tǒng)在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室投入使用，國內(nèi)尚未有關(guān)于BD Kiestra InoqulA應(yīng)用的報(bào)道。為此，本研究通過觀察儀器接種分離到的單個(gè)菌落數(shù)、菌種數(shù)、總的菌落計(jì)數(shù)和陽性率，并與手工方法比對(duì)，進(jìn)而對(duì)BD Kiestra InoqulA性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年10-11月廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院各臨床科室送檢的“中段尿培養(yǎng)、菌落計(jì)數(shù)”標(biāo)本810例和“需氧+厭氧培養(yǎng)”的血/無菌體液陽性標(biāo)本120例(瓶)。所有標(biāo)本按照本實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本采集手冊(cè)要求留取。

1.2 方法

1.2.1儀器與試劑

BD Kiestra InoqulA全自動(dòng)標(biāo)本處理系統(tǒng)、BACTEC FX血培養(yǎng)儀、比濁儀(美國BD公司)，MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀(德國Bruker公司)，CO2培養(yǎng)箱(香港立康)，加樣槍(德國Eppendorf公司)；真空含防腐劑尿管、血培養(yǎng)瓶(美國BD公司)，一次性10 μL定量接種環(huán)(英國MWE公司)，9 cm血瓊脂平板(江門凱林貿(mào)易有限公司)；α-氰基-4羥基肉桂酸(HCCA，美國Sigma-Aldrich公司)，接種培養(yǎng)液(美國BD公司)。

1.2.2質(zhì)控菌株

大腸埃希菌ATCC25922(隨廣東省臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評(píng)標(biāo)本附送)。

1.2.3尿標(biāo)本接種

將當(dāng)天送檢的尿標(biāo)本先上機(jī)接種(Z字劃線)，再進(jìn)行手工接種。手工接種：將尿標(biāo)本顛倒混勻，開蓋，用10 μL定量接種環(huán)垂直浸入尿液標(biāo)本表面下3～5 mm，將標(biāo)本吸至環(huán)中；在血瓊脂平板上劃十字，再進(jìn)行密集均勻涂布。

1.2.4血/無菌體液培養(yǎng)陽性標(biāo)本接種

75%乙醇消毒陽性培養(yǎng)瓶瓶口，顛倒培養(yǎng)瓶混勻菌液，用2 mL無菌注射器抽取2 mL菌液打入BD真空尿管里，先上機(jī)接種(四區(qū)劃線)，再進(jìn)行手工接種。手工接種：吸取標(biāo)本方法同尿接種，在血瓊脂平板第一區(qū)密集均勻涂布，四區(qū)劃線。

1.2.5培養(yǎng)及結(jié)果觀察

標(biāo)本接種后，把血瓊脂平板放入5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，如遇菌落生長(zhǎng)不良的標(biāo)本培養(yǎng)48 h，觀察菌落生長(zhǎng)情況。930例標(biāo)本皆進(jìn)行儀器和手工接種比對(duì)，記錄平板上可計(jì)數(shù)的單個(gè)菌落數(shù)、菌落總數(shù)(換算為cfu/mL)和菌種數(shù)。

1.2.6MALDI-TOF MS菌種鑒定

對(duì)懷疑兩種或以上菌落生長(zhǎng)的標(biāo)本，作質(zhì)譜鑒定，以確認(rèn)菌種數(shù)。用牙簽挑取單個(gè)菌落，均勻點(diǎn)涂到靶板上；吸取1 μL 70%甲酸涂敷到標(biāo)本上；吸取1 μL HCCA基質(zhì)液涂敷到標(biāo)本上，待干燥后上機(jī)。

1.2.7質(zhì)量控制及交叉污染試驗(yàn)

將ATCC25922用接種培養(yǎng)液制備0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊募?xì)菌混懸液，用加樣槍吸取10 μL加到BD真空尿管里，再加2 mL接種培養(yǎng)液稀釋200倍作為陽性質(zhì)控，放置在儀器標(biāo)本架的1號(hào)位；用無菌注射器抽取2 mL接種培養(yǎng)液打入BD真空尿管里，制作9管，作為陰性質(zhì)控，放置在儀器標(biāo)本架的2～10號(hào)位。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)控及交叉污染試驗(yàn)結(jié)果

陽性質(zhì)控經(jīng)儀器接種后，培養(yǎng)24 h為陽性結(jié)果，質(zhì)譜鑒定為大腸埃希菌。其余9個(gè)陰性質(zhì)控均未培養(yǎng)出細(xì)菌。

2.2 兩種接種方法的單個(gè)菌落分離效果比較

930例標(biāo)本中20例出現(xiàn)兩種接種方法“陰陽不符”的情況。在未能確認(rèn)是操作污染、接種能力等因素所致的情況下，只選取兩種接種方法均陽性的標(biāo)本進(jìn)行單個(gè)菌落分離效果的比較。無論是尿液還是血/無菌體液標(biāo)本，經(jīng)儀器接種比手工接種分離得到更多的單個(gè)菌落，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1、圖1。

A:儀器法Z字劃線(尿)；B:手工法密集涂布(尿)；C:儀器法四區(qū)劃線(血)；D:手工法四區(qū)劃線(血)。

表1 兩種接種方法均陽性的標(biāo)本接種效果的比較個(gè))

2.3 兩種接種方法的接種陽性率比較

219例尿陽性培養(yǎng)標(biāo)本和120例血陽性培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)兩種接種方法接種得到一致的陽性率，均為100%。930例標(biāo)本中，儀器法和手工法的接種陽性率為分別是37%和38%，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 930例標(biāo)本兩種接種方法陽性率的比較(n)

2.4 兩種接種方法的尿培養(yǎng)結(jié)果比較

手工法接種的標(biāo)本中，菌落總數(shù)大于或等于105cfu/mL和大于或等于104cfu/mL的標(biāo)本都要比儀器法接種的多，菌落總數(shù)大于或等于102cfu/mL的標(biāo)本卻比儀器法少；從分離得到的菌種數(shù)來看，手工法接種分離到1種或大于2種菌的標(biāo)本要比儀器法多，而分離到2種菌卻比儀器法少，見表3。

表3 兩種接種方法的尿培養(yǎng)結(jié)果比較(n)

3 討 論

微生物檢測(cè)流程的復(fù)雜性使臨床微生物實(shí)驗(yàn)室的自動(dòng)化、智能化建設(shè)滯后于其他專業(yè)[6]。在廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院，實(shí)習(xí)生和進(jìn)修生參與了大量標(biāo)本接種的工作，因人員長(zhǎng)期輪換且水平不一，很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的操作。接種是微生物檢測(cè)流程的第一步，有無菌生長(zhǎng)、菌落計(jì)數(shù)及菌種數(shù)直接影響檢驗(yàn)人員對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的判斷。因此，確保微生物檢驗(yàn)的質(zhì)量，必須盡可能實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的操作。

2015年，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室使用我國第1臺(tái)BD Kiestra InoqulA全自動(dòng)標(biāo)本處理系統(tǒng)。該儀器能通過自動(dòng)識(shí)別標(biāo)本類型、自動(dòng)選擇培養(yǎng)皿種類、自動(dòng)貼標(biāo)簽、自動(dòng)取樣，并通過磁珠在磁場(chǎng)的作用下進(jìn)行劃線接種。近幾年國內(nèi)幾家醫(yī)院和第三方檢測(cè)平臺(tái)華銀也陸續(xù)裝上了Kiestra InoqulA，甚至包含了自動(dòng)孵育系統(tǒng)和數(shù)字成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了微生物檢驗(yàn)全程自動(dòng)監(jiān)測(cè)。在國外，從2014年至今已有不少BD Kiestra應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道[8-10]，但在國內(nèi)尚無報(bào)道。FROMENT等[11]在2014年報(bào)道了BD Kiestra InoqulA在無交叉污染的情況下產(chǎn)生令人滿意的分離效果，比手工接種分離到了更多菌種類型。MORENO等[12]研究表明BD Kiestra InoqulA比傳統(tǒng)方法分離出更多的單個(gè)菌落。IVERSEN等[13]通過與Copan WASP對(duì)比，發(fā)現(xiàn)對(duì)于大于或等于105cfu/mL的尿標(biāo)本，BD Kiestra有更高的分離率；在單個(gè)菌落上，后者同樣擁有更出色的分離效果。CROXATTO等[14]報(bào)道BD Kiestra InoqulA對(duì)于濃度大于107cfu/mL的標(biāo)本也能分離出單個(gè)菌落，且比Copan WASP和手工接種分離得到更多的菌種，同時(shí)減少了實(shí)驗(yàn)室的工作量與工作成本。甚至有研究發(fā)現(xiàn)，使用BD Kiestra InoqulA后，有更多的陰道加德納菌和放線菌從尿標(biāo)本種分離出來[15]。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)儀器接種的標(biāo)本所得單個(gè)菌落數(shù)遠(yuǎn)高于手工接種。圖1可見無論是尿標(biāo)本“Z”字型劃線還是血/無菌體液四區(qū)劃線，都能清晰美觀地分離出不少單個(gè)菌落，避免了手工接種的參差和隨意。分區(qū)劃線的目的是為了分離出單個(gè)菌落，有無分出及分離的質(zhì)量，直接關(guān)系后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)219例尿液標(biāo)本經(jīng)兩種接種方法接種均陽性，而8例儀器法陽性而手工法陰性的標(biāo)本中，6例均為菌落總數(shù)大于或等于102cfu/mL(平板上只有1個(gè)或少數(shù)幾個(gè)菌落生長(zhǎng))，對(duì)于恥骨上膀胱穿刺采集、膀胱導(dǎo)尿采集及經(jīng)前列腺按摩后排尿采集的尿液標(biāo)本，菌落總數(shù)達(dá)到大于或等于102cfu/mL需要做鑒定或(和)藥敏試驗(yàn)[16]，這或許是儀器優(yōu)越性能的體現(xiàn)；12例儀器法陰性而手工法陽性的標(biāo)本中，1例大于或等于102cfu/mL，6例大于或等于104cfu/mL，5例大于或等于105cfu/mL。不可置否的是，儀器法采用經(jīng)校準(zhǔn)的加樣槍和配套帶濾芯的槍頭加樣，和手工法的一次性定量接種環(huán)相比，其擁有更精確的加樣量。加之手工加樣涉及手工開關(guān)標(biāo)本管、手工接種及劃線分離等可能出現(xiàn)錯(cuò)誤的步驟。故手工法比儀器法多出4例的陽性或許跟上述原因有關(guān)。盡管兩種方法的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但由于尿培養(yǎng)后續(xù)的鑒定及藥敏試驗(yàn)跟菌落總數(shù)和菌種類別及菌種數(shù)直接相關(guān)，故保證加樣量、實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化操作必不可少。否則，個(gè)別報(bào)告的過度藥敏試驗(yàn)或漏報(bào)，將影響臨床的診療決策。在分離的菌落總數(shù)和菌種數(shù)方面，其中兩例標(biāo)本經(jīng)儀器法接種后，通過單個(gè)菌落更容易識(shí)別出有兩種菌生長(zhǎng)，挑取單個(gè)菌落質(zhì)譜鑒定確認(rèn)為兩種菌，而手工法分不出單個(gè)菌落。對(duì)于陽性血培養(yǎng)來說，第一時(shí)間識(shí)別出菌種的數(shù)量和種類，方能及時(shí)把一級(jí)報(bào)告反饋給臨床。假設(shè)能做到采血量準(zhǔn)確、嚴(yán)格把控上機(jī)時(shí)間，那么通過標(biāo)準(zhǔn)化的標(biāo)本處理得到的總菌落計(jì)數(shù)可以對(duì)血流感染的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)起到更準(zhǔn)確的指導(dǎo)意義。

綜上所述，BD Kiestra InoqulA全自動(dòng)微生物標(biāo)本處理系統(tǒng)與傳統(tǒng)的手工接種方法相比表現(xiàn)出了良好的性能。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)為臨床微生物實(shí)驗(yàn)室建立智能化管理提供了借鑒。