萬騰飛，呂 彥，劉 亮△

(北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院：1.干一科；2.神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110016)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種起病隱匿、進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進性記憶和認知功能障礙及神經(jīng)精神癥狀[1]。AD早期的病理改變主要表現(xiàn)為淀粉樣蛋白的沉積(β-amyloid，Aβ)、神經(jīng)纖維纏結(jié)和突觸的丟失。既往研究表明，通過促進AD小鼠的突觸形成可有效改善認知功能[2]。而成對免疫球蛋白樣受體B(paired-immunoglobulin-like receptor B，PirB)能作為Aβ的受體，使絲切蛋白去磷酸化并活化，導(dǎo)致突觸的丟失和可塑性的降低[3]。肝X 受體(liver X receptor，LXR)包括 LXRα和 LXRβ兩型，屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的內(nèi)源性LXRβ活化能夠有效調(diào)節(jié)脂代謝、神經(jīng)炎癥及突觸可塑性[4]。然而，LXRβ能否通過PirB調(diào)節(jié)海馬突觸可塑性來改善AD小鼠的認知功能障礙目前尚缺乏報道。本研究采用經(jīng)典的APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠，通過給予LXRβ激動劑，檢測對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的改善作用，并探討LXRβ對PirB的影響和對海馬組織突觸形成的調(diào)節(jié)作用與機制，旨在為治療AD引起的學(xué)習(xí)認知障礙提供治療靶點，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試劑

LXRβ激動劑T0901317(美國Sigma公司)、PirB抗體(美國R&D公司)、β-actin抗體(英國Abcam公司)、Synapsin抗體(英國Abcam公司)、PSD-95抗體(英國Abcam公司)、生物素二抗(美國Life Technologies公司)等。

1.1.2實驗動物

20只APP/PS1轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠及10只同窩野生(wild-type，WT)小鼠購于南京模式動物中心，9個月齡，雄性，所有實驗小鼠飼養(yǎng)在溫度與濕度適宜的潔凈環(huán)境中，自由攝食，分籠飼養(yǎng)。所有動物實驗按照實驗動物管理及保護的有關(guān)規(guī)定進行。

1.2 方法

1.2.1實驗分組與藥物處理

WT小鼠作為對照組(WT組，n=10)，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠分為AD組(AD組，n=10)和T0901317處理組(AD+T0組，n=10)。其中AD+T0組小鼠采用灌胃給予50 mg/kg的T0901317，連續(xù)處理14 d，WT組和AD組給予同等劑量的二甲基亞砜(DMSO)溶劑。

1.2.2新物體識別實驗

參考文獻[5]的方法，對小鼠進行新物體識別行為學(xué)檢測。具體操作如下：先將兩個完全相同的圓柱形物體(A物體)分別放在測試箱的兩側(cè)，放入小鼠讓其在箱內(nèi)適應(yīng)3 min，再讓小鼠休息15 min，進行測試階段，將一側(cè)的圓柱形物體換為立方體盒(B物體)，立方體盒底面邊長與之前的圓柱體盒直徑一樣，然后將待測試小鼠放入測試箱中，讓其自由探索3 min，采用Ethovision XT軟件記錄并分析小鼠探索新物體及舊物體的時間，即鼻尖距離物體邊緣小于2 cm，探索偏愛指數(shù)=小鼠探索新物體的時間(B)/小鼠探索所有物體的總時間(A+B)×100%。

1.2.3水迷宮行為學(xué)實驗

參考文獻[6]的方法，對小鼠進行Morris水迷宮行為學(xué)檢測。具體操作如下：在正式進行行為學(xué)檢測的前1 d，將所有小鼠進行適應(yīng)性訓(xùn)練，消除不同實驗組小鼠對各個象限的探索偏愛。接著對所有小鼠進行4 d正式的實驗訓(xùn)練，將小鼠放入水中，讓小鼠游泳找到隱藏的平臺，總共限時60 s，若在60 s以內(nèi)未能找到平臺，則將小鼠放到平臺上，小鼠每次在平臺上停留20 s，記錄小鼠每次找到平臺的潛伏期。第5天將平臺撤去，檢測小鼠對平臺象限的記憶水平。每次試驗進行60 s，記錄小鼠找到正確象限的潛伏期，并記錄小鼠在60 s內(nèi)進入正確象限的總次數(shù)。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測

小鼠行為學(xué)檢測結(jié)束后，對小鼠進行灌注，取材，將腦組織利用4%及30%蔗糖溶液進行脫水固定后，進行冰凍切片。用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)對小鼠腦切片進行漂洗，加入一抗兔抗-離子鈣結(jié)合銜接分子-1(Iba-1)，放入4 ℃冰箱中孵育12 h，再用0.01 mol/L PBS進行漂洗后，加入生物素二抗，在37 ℃孵箱中反應(yīng)3 h，再用0.01 mol/L PBS進行漂洗，加入SABC溶液放入到37 ℃孵箱中反應(yīng)1 h，漂洗后采用DAB溶液進行顯色，貼片，采圖。統(tǒng)計海馬組織中Iba-1陽性細胞數(shù)，并計算出Iba-1陽性細胞數(shù)的密度，每組共采用4個標本進行檢測，以此反映小膠質(zhì)細胞數(shù)量。

1.2.5Western blot檢測

取材后，將小鼠腦組織置于冰上分離出海馬組織，加入組織裂解液，用組織破碎機對海馬組織進行研磨，離心后取上清液。利用BCA試劑盒對各標本的蛋白濃度進行測定。按照說明書上的流程配制十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳凝膠，加入蛋白樣品進行電泳，接著采用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%的脫脂奶粉溶液對PVDF膜進行封閉3 h，漂洗后分別加入對應(yīng)的抗體，在4 ℃條件下孵育12 h，采用TBST清洗后，分別加入對應(yīng)的二抗，在37 ℃條件下反應(yīng)2 h，漂洗后加入發(fā)光液，用Bio-Rad ChemiDoc MP多功能成像系統(tǒng)顯影采圖。最后利用ImageJ軟件對各條帶上的灰度值進行分析，并以β-actin為內(nèi)參計算出成對免疫球蛋白樣受體B(PirB)、海馬突觸相關(guān)蛋白Synapsin和PSD-95相對表達水平。并以WT組為參考，分別算出各組目的蛋白的相對表達水平，每組共采用4個標本進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 T0901317對AD小鼠認知功能的影響

新物體識別行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，AD組存在短時記憶的障礙，表現(xiàn)為對新物體的探索偏愛指數(shù)明顯低于WT組，而AD+T0組對新物體的探索偏愛指數(shù)明顯提升(P<0.05)。Morris水迷宮行為學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，在第5天測試階段，AD組在目標象限停留時間百分比明顯低于WT組(P<0.05)，AD組同時進入目標象限的次數(shù)也明顯低于WT組(P<0.05)。而AD+T0組在目標象限停留時間百分比及進入目標象限的次數(shù)明顯增加(P<0.05)，見圖1。

A：小鼠進行新物體識別實驗對新物體的探索偏愛指數(shù)；B：Morris水迷宮實驗中小鼠在目標象限停留時間所占的百分比；C：Morris水迷宮實驗中各組小鼠進入目標象限的次數(shù);a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+T0組比較。

2.2 T0901317對AD小鼠海馬組織Iba-1陽性細胞數(shù)的影響

免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，AD組海馬組織Iba-1陽性細胞數(shù)比WT組多(P<0.05)，而AD+T0組海馬組織Iba-1陽性細胞數(shù)明顯降低(P<0.05)，見圖2。

A:WT組小鼠海馬組織Iba-1免疫組織化學(xué)染色圖；B：AD組小鼠海馬組織Iba-1免疫組織化學(xué)染色圖；C:AD+T0組小鼠海馬組織Iba-1免疫組織化學(xué)染色圖；D：3組小鼠海馬組織Iba-1陽性細胞密度統(tǒng)計圖;a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+T0組比較。

2.3 T0901317對AD小鼠海馬組織PirB、Synapsin和PSD-95表達水平的影響

Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與WT組比較，AD組海馬組織PirB表達水平升高，Synapsin和PSD-95表達水平降低(P<0.05)，而AD+T0組PirB表達水平降低，Synapsin和PSD-95表達水平明顯升高(P<0.05)，見圖3。

A：Western blot檢測；B：小鼠海馬組織PirB半定量分析 C:小鼠海馬組織Synapsin半定量分析；D:小鼠海馬組織PSD-95半定量分析,a：P<0.05，與WT組比較；b：P<0.05，與AD+T0組比較。

3 討 論

AD是一種起病隱匿的進行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。AD患者最早表現(xiàn)出的臨床癥狀為海馬相關(guān)的記憶丟失，是突觸功能異常的結(jié)果。使用功能磁共振成像(fMRI)在體腦成像技術(shù)，發(fā)現(xiàn)與記憶相關(guān)的腦區(qū)往往形成異常的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系[7]。采用電子顯微鏡進行超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)AD患者海馬區(qū)域突觸丟失明顯，且這種突觸丟失的嚴重程度與記憶減退的程度明顯相關(guān)[8]。BERTONI-FREDDARI等[9]證實AD小鼠海馬組織平均單個神經(jīng)元的突觸數(shù)較非AD對照組減少50%。AD患者腦組織內(nèi)突觸相關(guān)蛋白(Synapsin和PSD-95)的丟失與AD患者認知功能減退的程度密切相關(guān)[10]。采用免疫組織化學(xué)與免疫印跡分析表明AD患者腦組織中突觸前蛋白與突觸后蛋白較同齡非AD對照組明顯降低，亦提示這些特異的突觸蛋白參與AD病的進程[11]。同樣，在AD動物模型中觀察到AD早期的病理改變主要表現(xiàn)為淀粉樣蛋白的沉積和突觸的丟失。此外，通過將胚胎干細胞來源的神經(jīng)前體細胞移植入AD模型大鼠內(nèi)能分化為神經(jīng)元并與靶區(qū)神經(jīng)元建立了突觸，并檢測到學(xué)習(xí)記憶得到改善[12]。因此，對AD中突觸功能調(diào)控機制研究為AD治療提供重要途徑。本研究結(jié)果提示，LXRβ激動劑T0901317可以通過調(diào)節(jié)AD小鼠海馬組織的突觸可塑性來改善認知功能。

LXR包括 LXRα和 LXRβ兩型，屬于配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子。其中LXRα主要分布在與脂代謝相關(guān)的組織與細胞如肝臟、小腸、脂肪組織等，LXRβ在體內(nèi)有更廣泛的表達。研究資料顯示LXR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中亦有重要功能，其中LXRβ為主要的亞型表達受體。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中內(nèi)源性LXRβ活化能夠有效調(diào)節(jié)脂代謝與炎性反應(yīng)[13]。當腦組織的炎癥使疾病加重時，小膠質(zhì)細胞會過多活化產(chǎn)生嚴重的神經(jīng)毒性[14]。已有研究表明，LXRβ能通過核因子-κB(NF-κB)通路來減少AD小鼠中的星形膠質(zhì)細胞形成，從而防止膽堿能神經(jīng)元被損傷[15]。同時，LXRβ能夠促進小膠質(zhì)細胞對腦內(nèi)的Aβ蛋白的清除[16]。在本研究中，也進一步證實了，LXRβ激動劑T0901317可以明顯降低AD小鼠海馬組織的Iba-1陽性細胞數(shù)，從而抑制腦內(nèi)的過度炎性反應(yīng)。

PirB是存在于小鼠體內(nèi)和人類白細胞免疫球樣蛋白受體B2(human leukocyte immunoglobulin-like receptor B2，LILRB2)同源的一類膜蛋白受體。起初發(fā)現(xiàn)，在免疫系統(tǒng)中PirB在B淋巴細胞、肥大細胞、巨噬細胞、粒細胞和樹突細胞中表達，能作為主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(MHCⅠ)的受體來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[17]。近期研究發(fā)現(xiàn)，PirB表達在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞中，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，PirB的表達水平增高，且能通過和軸突抑制生長因子Nogo、OMgp和MAG的相互作用來抑制軸突的生長和神經(jīng)元的可塑性[18-19]。此外，PirB的突變鼠，在視神經(jīng)損傷后對比對照組，表現(xiàn)出極強的視皮層的可塑性[20]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在AD小鼠中，PirB能作為Aβ的受體，使蛋白磷酸酶PP2A和PP2B上調(diào)，從而使絲切蛋白去磷酸化并活化，活化的絲切蛋白使肌動蛋白絲解聚，最終導(dǎo)致突觸的丟失和可塑性的丟失[3]。本研究也進一步發(fā)現(xiàn)，通過活化內(nèi)源的LXRβ可以降低AD小鼠海馬組織PirB的表達水平，同時上調(diào)突觸相關(guān)蛋白的表達，進而改善AD小鼠的認知功能，提示LXRβ可能通過PirB調(diào)節(jié)AD小鼠海馬的突觸可塑性，進而改善記憶和認知功能障礙。

綜上所述，本研究證實了LXRβ激動劑激活內(nèi)源性LXRβ會對AD所致的突觸損傷有一定的修復(fù)作用,并能改善AD小鼠的記憶和認知功能障礙。該研究可為治療AD提供新的靶點，并提供干預(yù)的措施以緩解AD引起的記憶和認知功能障礙，為臨床治療AD患者提供新的藥物可能。