甘建國高攀王曉毅

1.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院頭頸腫瘤外科 成都610041；

2.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心四川大學華西口腔醫(yī)院全科門診及急診科 成都610041

唇、口腔及口咽部惡性腫瘤近年來也成為了嚴重危害人類生命健康的重大疾病，約占總惡性腫瘤的3.8%，死亡人數(shù)約占3.6%，且均呈上升趨勢[1-3]。在中國，其死亡人數(shù)預計約占發(fā)病人數(shù)一半[4]，而北京地區(qū)僅口腔、口咽部發(fā)病率就約占其47.4%[5]。越來越多證據(jù)表明，腫瘤細胞可早期從原發(fā)部位進入血液循環(huán)，甚至早于機體出現(xiàn)相應臨床癥狀。進入血液循環(huán)的腫瘤細胞稱為循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）可沿著血液系統(tǒng)播散至全身各處，嚴重影響腫瘤患者的早期診斷和治療，可增加腫瘤轉移或復發(fā)概率，降低患者生存率，且導致無法對治療療效進行評價和判斷。由于CTCs數(shù)量相對較少（106~107個外周血白細胞中才有1個循環(huán)腫瘤細胞），其富集和研究技術非常困難[6]。

近年來，隨著檢測技術的進步，CTCs已應用于肺癌、乳腺癌、直腸癌、前列腺癌等腫瘤中，用于指導腫瘤的早期診斷、治療、療效評價和預后判斷[7-10]。但關于口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）的研究及臨床運用鮮有報道。本文對OSCC相關CTCs的研究現(xiàn)狀作一綜述，探索OSCC相關CTCs生物標志物的臨床意義，了解CTCs與OSCC進展及預后的關系，為通過靶向CTCs治療OSCC奠定理論基礎。

1 CTCs在OSCC中的形成與發(fā)展

CTCs是從原發(fā)灶脫落、釋放并轉移到血液中，與腫瘤轉移有關的細胞。其在OSCC中形成機制尚不十分清楚，大致過程分為：1）上皮間充質轉化形成，2）進入血液循環(huán)，3）逃避宿主免疫清除，4）轉移到遠處組織。

1.1 OSCC中上皮間充質轉化的結果

大量研究表明，上皮間充質轉化（epithelial mesenchymal transition，EMT）在腫瘤細胞遷移過程中起著重要作用[11-16]。EMT可使上皮細胞的形態(tài)結構發(fā)生改變、細胞極性丟失；細胞間黏附分子E-鈣黏蛋白表達被抑制，導致緊密連接喪失；同時，細胞骨架結構重組，由角蛋白轉變?yōu)椴ㄐ蔚鞍诪橹鞯募毎羌?。一系列變化導致OSCC上皮細胞黏附能力下降，可塑性增強，從而獲得遷移和侵襲能力，進而能夠突破基底膜，從原發(fā)灶浸入周圍血管中形成CTCs。EMT主要由轉錄調(diào)控、選擇性剪接、非編碼RNA調(diào)控和翻譯后修飾等相互關聯(lián)且密切聯(lián)系的環(huán)節(jié)所調(diào)控的，形成一張EMT調(diào)控網(wǎng)絡[11-12]。而EMT誘導轉錄因子（EMT-inducing transcription factors，EMT-TFs）構成了調(diào)控網(wǎng)絡的大體框架。EMT-TFs促進細胞呈現(xiàn)間充質表型，使上皮表型處于沉默狀態(tài)[11]。EMT-TFs水平因腫瘤異質性而表達不同，在頭頸部鱗狀細胞癌中Snail1、Snail2、ZEB1、ZEB2、TWIST1等都呈上調(diào)趨勢[12]。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，EMT還存在中間狀態(tài)，即上皮型與間充質型混合的表型。關于腫瘤異質性與EMT表型相關性的猜想也相繼提出，但目前尚缺少證據(jù)證實OSCC異質性與EMT之間的關系。

此外，間充質阿米巴樣轉化（mesenchymalamoeboid transition，MAT）除了在淋巴瘤、小細胞肺癌等在OSCC中也被觀察到[17-19]。間充質細胞在低黏附和強束縛條件下可向阿米巴樣遷移轉化，在不發(fā)生特異性基因改變的情況下自發(fā)地逃離原發(fā)灶[20]。與EMT相比，MAT通過增加細胞收縮性，穿過不同孔徑、形狀的間隙，從而速度更快[17]。在OSCC中不同生存條件下可能存在上皮細胞轉化為間充質細胞，然后再轉化為阿米巴樣細胞，若這一連續(xù)過程發(fā)生將會大大提高OSCC的復發(fā)率和轉移率。

1.2 OSCC中CTCs逃避宿主免疫清除的機制

影響CTCs在血流中存活的主要因素有多個方面，如細胞錨定喪失、血液機械應力和免疫系統(tǒng)攻擊等。失巢凋亡為細胞在遷移過程中丟失與細胞外基質黏附作用而導致的一種程序性死亡，特別是上皮細胞[21]。CTCs可活化特定的生存信號避免失巢凋亡[12]；或通過調(diào)節(jié)黏附分子的表達，穩(wěn)定與細胞外基質的接觸，影響下游相關信號通路，阻止誘導死亡信號。脫離原發(fā)灶和細胞外基質，血流剪切力、血管內(nèi)高壓以及機械形變等血流動力學機械應力均可以誘導CTCs死亡[22]。絕大多數(shù)CTCs由于血液的機械作用而發(fā)生死亡或凋亡，剩下少數(shù)CTCs將面臨被機體免疫系統(tǒng)清除的可能。自然殺傷（natural killer，NK）細胞表面NKG2D受體可識別腫瘤細胞表面分子MICA和MICB，激活固有免疫應答。也有研究[22]表明，一些腫瘤細胞可通過金屬蛋白酶使MICA、MICB等NKG2D配體脫落，導致配體數(shù)量減少，從而逃脫免疫清除。除了CTCs自身調(diào)控與改變，血細胞也起著“幫兇”的作用。血小板可直接攝取CTCs釋放的蛋白質和mRNA，而CTCs可直接刺激血小板的活化和蛋白合成，最終形成腫瘤相關血小板（tumor-educated platelets，TEPs）[23-24]。TEPs與CTCs表面受體結合，導致NK細胞不能直接與受體結合激活相關通路，從而協(xié)助CTCs逃脫免疫監(jiān)測。中性粒細胞被證明可抑制NK細胞功能促進腫瘤細胞免疫逃逸；分泌白細胞介素1β和基質金屬蛋白酶促進腫瘤細胞的轉移[25]。中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（neutrophil extracellular traps，NETs）可捕獲CTCs，分泌相關細胞因子，延長CTCs細胞周期，促進轉移。當TEPs和中性粒細胞積聚在CTCs周圍，其分子間相互連接和作用可增加CTCs對血流動力學的耐受能力以及在血管中的黏附和滯留，從而穿過血管內(nèi)皮屏障，外滲到遠處組織后形成彌散性腫瘤細胞（disseminated tumor cells，DTCs）。當然CTCs也能隨著血液循環(huán)重新定植到原發(fā)灶，進一步促進原發(fā)灶的生長，這種現(xiàn)象叫做CTCs歸巢[26]。

CTCs聚集成簇的機制尚存在很多爭議，回顧文獻總結為以下機制：1）腫瘤細胞成簇脫落滲入血管；2）單個CTC在血管內(nèi)增殖成簇；3）CTCs與血細胞相互作用表現(xiàn)成簇，并和血管內(nèi)其他物質結合形成循環(huán)腫瘤微栓子（circulating tumor microemboli，CTM）。研究顯示，單個與成簇CTCs的基因表達圖譜存在差異，這種差異可能導致成簇CTCs比單個細胞更有效地定植并形成轉移[27]。成簇CTCs可維持細胞間接觸使內(nèi)部細胞免受免疫攻擊，更大程度上保留原發(fā)腫瘤的特征與表型，從而遷移轉移能力更強。

1.3 OSCC中基于CTCs的轉移定植過程

OSCC的轉移定植是復雜的過程，而CTCs則是貫穿整個過程的關鍵。有學者[28]認為，腫瘤的轉移擴散可能遵循2種模式：血運轉移和依賴于淋巴系統(tǒng)的轉移。在后者中，腫瘤細胞早期從原發(fā)灶擴散到淋巴結，并在淋巴結中增殖。隨著增殖擴散，腫瘤細胞再次突破淋巴結周圍血管進入循環(huán)系統(tǒng)轉移到遠處器官，形成轉移病灶[29]?？谇活M面除血供豐富以外，還有密集的淋巴結群，而頸部淋巴結轉移、轉移數(shù)量和淋巴結外擴散都是OSCC重要的預后因素，可使患者的生存率明顯降低。與乳腺癌相比，在OSCC中遠處轉移與淋巴結轉移之間的關系會更加密切。目前尚無有力證據(jù)揭示這兩種轉移方式之間的具體關系，在早期OSCC中是以非依賴淋巴結的血運轉移為主還是以依賴淋巴結的血運轉移為主；或淋巴結轉移是否會促進加強血運轉移，使得CTCs的數(shù)量出現(xiàn)明顯增加從更容易發(fā)生早期轉移；再或者兩者在腫瘤早期同時出現(xiàn)并相互刺激，影響患者預后。這些亟待解決的問題也為OSCC中CTCs的研究提供了新的方向。

2 OSCC中常用的CTCs檢測方法

CTCs檢測技術也被稱為液體活檢技術，主要由富集（分離）和檢測（鑒定）2個部分組成。

2.1 依賴抗原或標簽的方法——免疫磁珠分離法

2.1.1 陽性分離方法 在OSCC中常用的陽性分離法是利用OSCC上皮細胞表達的上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）作為富集分離手段，如CellSeach、AdnaTestTM、Mag-SweeperR等[30]。CellSeach系統(tǒng)是目前美國食品與藥品監(jiān)督管理局批準的CTCs檢測技術，被認為是檢測CTCs的金標準[31]。以上基于EpCAM的方法具有一定的局限性，有可能漏檢EpCAM陰性或表達下調(diào)的CTCs[32]。此外與EpCAM抗體結合后還可能改變CTCs的原始狀態(tài)，降低進一步生物學研究的可靠性[33]。

2.1.2 陰性分離方法 在OSCC中常用的陰性分離方法是利用CD45標記白細胞，并將其清除，從而留下未被標記的CTCs?；谶@一原理的有Easy-SepR和RosetteSepR系統(tǒng)。PowerMag系統(tǒng)比Easy-SepR系統(tǒng)能更有效地清除CD45陽性的白細胞，也能更有效地回收CTCs[34]。但這些技術不可避免地導致CTCs純度比直接利用CTCs的陽性技術低，且白細胞清除過程也可能導致表達CD45的非傳統(tǒng)CTCs被意外刪除，導致CTCs被低估[35-36]。

2.2 不依賴抗原或標簽的方法——基于細胞大小分離法

基于上皮腫瘤細胞大小分離法（isolation by size of epithelial tumor cells，ISETTM）使用過濾裝置優(yōu)先捕獲直徑大于8μm的腫瘤細胞，該技術不依賴于CTCs表面分子，不需要樣品預處理，允許使用高流速檢測。該方法可用于包括非上皮源性的腫瘤細胞。ISETTM避免了EpCAM表達下調(diào)的問題，但存在細胞大小重疊的現(xiàn)象，并且干細胞樣CTCs比普通CTCs更小且更具有侵襲性，對腫瘤轉移定植研究具有重要的意義[37]。而Park等[38]通過細胞變形能力分離CTCs和白細胞來提高靈敏度。該研究證實，基于變形能力的分離方法更能提高富集能力，這提供了一種高選擇性的物理富集過程。

2.3 微流體芯片技術

第2代微流體芯片技術包括CTC-Chip和Herringbone-Chip（HB-Chip），然而這2種芯片富集后的細胞活力往往受到損害，會影響下游分析和功能研究。

第3代微流體技術CTC-iChip將基于細胞大小的分離法與陽性分離法或陰性分離法相結合，提高了CTCs捕獲率和處理速率[35]。CTC-iChip結合了2個微流體芯片。在CTC-iChip1中減輕全血體積，有核細胞通過確定性側向位移從整個血液中分離出來。在CTC-iChip2中完成磁力分離，通過磁泳技術從未標記的CTCs中將其分離[33]。

2.4 CTCs相關新技術

2.4.1 免疫組織化學成像分析法 高清CTCs成像實驗（high definition-CTC assay，HD-CTC）可以在不依賴細胞表面蛋白的基礎上富集并高清地呈現(xiàn)出CTCs。研究[10]顯示，HD-CTC技術較Cell-Search系統(tǒng)檢出率更高并能從88%的轉移性癌患者血液中檢測出CTCs簇的存在。目前尚無研究在OSCC中運用HD-CTC技術。

2.4.2 納米結合技術 納米技術的飛速發(fā)展，近年來也受到了科研人員的廣泛關注。磁性納米顆?？膳cCellSearch結合富集血液樣本中的CTCs，顯示出強大的臨床應用潛力；納米材料能更容易地進行多種路徑檢測和分析，這有助于對CTCs異質性的了解[39]。該技術可開發(fā)用于研究OSCC異質性與EMT表型之間的關系，用于揭示OSCC轉移和復發(fā)的個體差異性。

2.4.3 體內(nèi)捕獲裝置 CellCollectorR已用于捕獲體內(nèi)的CTCs。在體內(nèi)應用時，通過標準導管進入患者靜脈30 min，功能化表面直接與血管內(nèi)的細胞接觸，EpCAM（+）細胞被捕獲。從患者體內(nèi)取出后，黏附的CTCs可以進行免疫細胞化學染色和評估[40]。目前該技術尚未普及，但可預計其未來發(fā)展，或用于OSCC患者術中檢測CTCs，可精準評估OSCC外科操作對CTCs數(shù)量的影響。

有研究詳細介紹了分離CTCs的各種常用方法并比較了其優(yōu)缺點[31,38]，筆者結合本文加以分析后進行了總結（表1）。

表1 CTCs常用檢測方法比較Tab 1 Comparison of commonly used detection methods of CTCs

3 CTCs在OSCC中的研究現(xiàn)狀

3.1 CTCs與OSCC臨床的關系

學者們[41-42]證實了CTCs在頭頸部鱗癌（head neck squamous cell carcinoma，HNSCC）中存在。在CTCs計數(shù)與臨床病理因素的關系分析中，Buglione等[42]運用CellSearch技術在1項回顧性研究中發(fā)現(xiàn)，Ⅳ期口咽癌患者較Ⅰ至Ⅲ期患者的更易檢出CTCs，但差異無統(tǒng)計學意義。Bozec等[43]用相同的技術評估HNSCC中CTCs與臨床因素的關系顯示，CTCs與患者的年齡和淋巴結轉移存在關系。而Kawada等[44]運用微濾系統(tǒng)CellSieve分析后認為晚期（Ⅲ/Ⅳ期）患者的CTCs計數(shù)明顯高于早期（Ⅰ/Ⅱ期）患者；同時CTCs計數(shù)與T分級相關，T3/4患者的CTCs明顯多于T1/2患者。CTCs計數(shù)與OSCC的TNM分期相關，越是晚期或復發(fā)或淋巴結轉移的患者，其血液中CTCs檢出率越高。而CTCs陽性的OSCC患者的復發(fā)率較高，局部淋巴結轉移率較高，腫瘤多為晚期。與其他臨床病理特征如年齡、性別和腫瘤組織學等沒有相關性。

3.2 CTCs與OSCC預后的關系

Gr?be等[45]采用CellSearch技術在一項納入了110例OSCC術后未補充放化療患者的CTCs與預后關系的研究中揭示CTCs是OSCC患者無瘤生存期的重要獨立預測因素和獨立預后標志物，在不同疾病階段預測復發(fā)的敏感性高于常規(guī)分期。同樣的，有學者采用陰性分離方法EasySepR對同步放化療的HNSCC患者的研究中顯示，CTCs計數(shù)的變化與無進展生存期和總生存期相關。多因素分析發(fā)現(xiàn)，CTCs下降狀態(tài)是無進展生存期和總生存期的獨立預后因素[46]。然而不同的是，Tinhofer等[47]檢測了144名HNSCC術后補充放化療患者的CTCs的前瞻性研究結果認為總體上CTCs不能預測患者的總生存率和無瘤生存率。納入17項研究的Meta分析[48]發(fā)現(xiàn)，CTCs檢測陽性與總生存期、無瘤生存期和無進展生存期顯著相關。而另外一項納入了20項研究的Meta分析也得出來相似的結論，同時還發(fā)現(xiàn)T3-T4組、N1-N3組、Ⅲ-Ⅳ組的CTCs陽性率較高[49]。這2項Meta分析雖然并未將OSCC單獨列出，其數(shù)據(jù)分析包含了所有類型的HNSCC。從總體數(shù)據(jù)和相關的研究來看，CTCs是OSCC的1種預后標志物，且與總生存期、無瘤生存期和無進展生存期顯著相關。

3.3 OSCC中CTCs新型標志物

除此之外，其他新型生物標志物也相繼提出。研究發(fā)現(xiàn)，同一患者的單個和成簇CTCs的盤狀球蛋白的表達具有明顯差異，敲減plakoglobin基因后終止了成簇CTCs的形成[50]。而另一項研究[51]發(fā)現(xiàn)plakoglobin在OSCC中過表達，能夠促進OSCC細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡。原發(fā)灶中plakoglobin的高表達或許可作為定性判斷CTCs數(shù)量或成簇的標志物，也可成為OSCC的潛在預后標志物，這也從另一個角度解釋了OSCC中CTCs成簇的機制。平足蛋白（podoplanin，PDPN）已被證實一種OSCC預后不良的生物標志物[52]。Hsieh等[53]對PDPN在CTCs中的表達對預后的影響研究中，注意到無論治療方式和腫瘤分期，PDPN+/EpCAM+-CTCs比值都是一個獨立的預后因素。目前尚無研究將上述比值用于OSCC的臨床評估。但將2種生物標志物相結合的方法，不僅僅能提高預測的靈敏度，也可能為OSCCD的臨床運用提供新的視角。程序性細胞死亡受體-1（programmed cell death receptor-1，PD-1）與其配體PD-L1結合后可啟動T細胞程序性死亡，而PD-L1在CTCs中呈現(xiàn)高表達會影響OSCC的預后。Strati等[54]在納入113名HNSCC患者的研究中通過多因素分析發(fā)現(xiàn)治療結束時CTCs高表達PD-L1是無進展生存期和總生存期的獨立預后因素。治療結束時PD-L1無過表達與完全緩解密切相關。PD-L1或將成為預測OSCC預后的新標志物，且目前PD-L1作用機制研究比較明了，有望將PD-L1與其他標志物相結合用于檢測OSCC患者中的CTCs，從而降低OSCC的轉移與復發(fā)，且PD-L1陽性的CTCs可以用來監(jiān)測OSCC對治療的反應，成為藥物治療OSCC新的靶點。目前，PD-1的抗體可用于治療復發(fā)或轉移性HNSCC，隨著陽性臨床數(shù)據(jù)的出現(xiàn)，將使更多患者獲益[36]。

3.4 CTCs與OSCC治療手段的關系

手術治療仍然是OSCC目前最主要的治療手段，而機械操作導致腫瘤細胞脫落的討論研究也一直備受關注。為探討外科操作與OSCC血循播散的關系，有學者[55-56]發(fā)現(xiàn)，外科機械操作有促進腫瘤細胞血運轉移的可能。Jatana等[57]對38例HNSCC患者術前術后的76份血樣進行了檢測，有60.5%的患者術后每毫升CTCs數(shù)量平均增加6.63倍。由于豐富的血管和淋巴，在OSCC手術中外科侵襲性操作不可避免的促進了癌細胞進入血液形成CTCs，增加腫瘤遠處轉移的風險?？梢岳皿w內(nèi)捕獲裝置CellCollectorR在進行外科操作時進行體內(nèi)檢測并富集CTCs，指導OSCC的治療、監(jiān)測治療反應以及判斷預后，以達到減少遠處轉移或復發(fā)的風險，但由于該技術弊端在于屬于有創(chuàng)性操作，患者接受度和配合度較低，且對外科操作要求較高，所以開展相關臨床研究尚有一定的困難。

4 結束語

綜上所述，CTCs與OSCC的TNM分期相關，可以作為判斷OSCC預后的指標之一，可與其他生物標志物聯(lián)合評估OSCC的預后。但關于OSCC的CTCs研究較少，且多包含在HNSCC的研究中，缺少同質的OSCC相關研究，可能導致評估存在差異。關于檢測技術，目前多用CellSearchTM系統(tǒng)檢測OSCC中的CTCs。隨著技術發(fā)展，未來CTCs的檢出會更加靈敏和便捷，有望將CTCs檢測技術用于OSCC相關的體內(nèi)實驗和治療當中。針對不同EMT表型的OSCC，可開展大樣本研究，以進一步了解OSCC中EMT與CTCs異質性的關系以確定不同群體中CTCs對于預后影響的差異，并有助于臨床干預，以提高腫瘤的治療效果。此外，目前尚缺乏OSCC相關的CTCs體內(nèi)研究，用于指導外科操作以減少機械操作導致腫瘤細胞脫落的可能性。OSCC的CTCs體外內(nèi)研究將有助于闡明OSCC具體轉移機制以及抗腫瘤載體的機制，為靶向CTCs治療OSCC奠定理論基礎。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。