龐 嵐，曾 倩，武學鋒，申 艷，李軍澎

(1. 邯鄲市婦幼保健院，河北 邯鄲 056000；2. 邯鄲市中心血站，河北 邯鄲 056000；3. 涉縣婦幼保健院，河北 涉縣 056400)

子宮內膜癌是發(fā)達國家惡性婦科腫瘤死亡的主要原因之一。 在中國,子宮內膜癌的發(fā)生在年輕人中更為常見，并表現出發(fā)病率和病死率逐步增高的趨勢[1]。子宮內膜癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移是一個極其復雜的過程，在子宮內膜單純性增生逐漸進展為非典型增生期間以及早期子宮內膜癌向晚期癌進展過程中多種分子均發(fā)生了變化[2]。因此，鑒定與子宮內膜癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉移密切相關的高度敏感和特異性分子標志物可以對子宮內膜癌患者的正確診斷和治療提供巨大幫助。轉移黏附蛋白(AEG-1)為HIV-1感染后人胎兒星形膠質細胞誘導的新型晚期反應基因。Song等[3]發(fā)現AEG-1的過表達與人非小細胞肺癌的腫瘤侵襲性和預后不良密切相關，且AEG-1可促進腫瘤生長、自噬和血管生成，并在很多癌癥轉移、恢復和化學抗性中發(fā)揮重要作用[4-6]，但有關其參與子宮內膜癌發(fā)病過程的機制研究仍然有限，尤其是其表達量變化與子宮內膜癌侵襲、轉移相關性報道少見。因此，本研究觀察了AEG-1在子宮內膜癌組織中的表達及其表達量與癌細胞侵襲和轉移的關系，旨在為進一步明確子宮內膜癌病理機制提供實驗依據。

1 資料和方法

1.1一般資料 收集2016年7月—2018年7月在邯鄲市婦幼保健院接受手術的48例子宮內膜癌患者組織標本、28例子宮內膜單純增生組織標本和30例正常子宮內膜組織標本。子宮內膜癌患者年齡32～63歲；手術后病理確認為子宮內膜腺癌；FIGO病理分期：Ⅰ+Ⅱ期39例，Ⅲ期9例；組織學分級：G1+G2級39例，G3級9例；淋巴轉移8例，無轉移40例。子宮內膜單純增生組織標本和正常子宮內膜組織標本均來自門診刮宮者。本研究經邯鄲市婦幼保健院倫理委員會審核批準。

1.2研究方法 測定各組織中AEG-1和基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表達量，分析二者表達量與子宮內膜癌患者病理特征的關系；檢測各組織中β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、CUL4A的mRNA表達量，Pearson分析AEG-1與MMP-9蛋白、β-catenin mRNA、CUL4A mRNA表達的相關性。

1.3檢測指標與方法

1.3.1AEG-1和MMP-9蛋白表達Western印跡法檢測 樣本裂解后，4 ℃下13 000 r/min離心15 min取上清液，應用BCA蛋白質濃度測量試劑盒(聯科生物技術有限公司)測量蛋白質濃度，加入5×SDS樣品緩沖液，隨后加入終濃度為5%的β-巰基乙醇(南京森北佳生物科技有限公司)使蛋白變性。根據蛋白質的分子量，制備12%分離凝膠和5%間隔凝膠(所有試劑購自德國Amresco公司)。使用PVDF膜和切成相同尺寸的6片濾紙進行膜轉移。甲醇浸泡PVDF膜后，加入緩沖溶液并將膜置于具有冰塊的盆中300 mAmp電泳1 h，將蛋白質轉移到膜上。轉膜后應用TBS-T配置的10%牛奶進行封閉，隨后孵育AEG-1和MMP-9一抗4 ℃過夜。次日洗滌后孵育二抗室溫1 h后ECL顯影檢測。 采用Quantity One軟件分析計算AEG-1、MMP-9表達量。

1.3.2β-catenin和CUL4A mRNA RT-PCR檢測 按照Trizolextraction 試劑盒說明進行總RNA提取。組織經勻漿、離心、與異丙醇混合、冰乙醇洗滌后，分光光度法檢測RNA純度和濃度，逆轉錄合成cDNA。將1 μg RNA與水和dT引物混合，在30 ℃下加熱10 min，在DNTPs逆轉錄酶和含有MgCl2(5 mmol/L)緩沖液下42 ℃溫育30 min。99 ℃加熱5 min終止反應，儲存?zhèn)溆谩⒖偣?.5 μL cDNA與水、引物和聚合酶混合進行PCR反應，每次反應的總體積為20 μL。引物序列和擴增條件：β-catenin上游為5’-TGGCAGCAACAGTCTTACC-3’，下游為5’-TCCACATCCTCTTCCTCAG-3’，擴增長度112 bp，退火溫度72 ℃；CUL4A上游為5’-CAGCGGCTCTGATTACAGACCTCG-3’，下游為5’-GTCTTCACAGGCCTGACGCAGT-3’，擴增長度121 bp，退火溫度65 ℃；GAPDH上游為5’-AGTTATTGTGTGCTGGGGACA-3’，下游為5’-CAGGCTCCAGSSGAAGTTGG-3’，擴增長度309 bp，退火溫度62 ℃。

2 結 果

2.1AEG-1和MMP-9蛋白表達情況 AEG-1蛋白在78 kD處出現，MMP-9蛋白在92 kD處存在，β-actin在43 kD處存在。子宮內膜癌組織中AEG-1和MMP-9蛋白表達量均較子宮內膜單純增生組織和正常子宮內膜組織中高(P均<0.05)，子宮內膜單純增生組織中較正常內膜組織中高(P均<0.05)。見圖1。

圖1 各子宮內膜組織中AEG-1和MMP-9蛋白表達情況

2.2AEG-1和MMP-9蛋白表達與子宮內膜癌患者臨床病理特征的關系 AEG-1和MMP-9蛋白表達與肌層浸潤、病理分期和淋巴轉移相關，在高病理分期、肌層浸潤深度≥1/2和淋巴轉移組織中表達量更高(P均<0.05)，但與組織學分級和年齡無關(P均>0.05)。見表1。

表1 AEG-1及MMP-9 蛋白表達量與子宮內膜癌患者臨床病理特征的關系

2.3β-catenin和CUL4A mRNA水平表達情況 子宮內膜癌組織中β-catenin和CUL4A mRNA表達量均較子宮內膜單純增生組織和正常子宮內膜組織中高(P均<0.05)，子宮內膜單純增生組織中β-catenin mRNA表達量較正常內膜組織中高(P<0.05)。見圖2。

圖2 各子宮內膜組織中 β-catenin和CUL4A mRNA表達情況

2.4AEG-1與MMP-9 蛋白及β-catenin mRNA和CUL4A mRNA表達的相關 Pearson相關分析顯示，子宮內膜癌組織中AEG-1表達量和MMP-9蛋白表達量(r=0.970，P<0.001)、β-catenin mRNA表達量(r=0.611，P=0.032)、CUL4A mRNA表達量(r=0.603，P=0.020)均呈顯著正相關。

3 討 論

AEG-1作為近年來發(fā)現的新型基因，已發(fā)現其在各種癌癥中過度表達，并參與腫瘤轉移[7]。在肺癌細胞中，AEG-1的mRNA表達量顯著高于正常細胞系，其高表達與臨床分期和淋巴結轉移相關[8]。Zhou等[9]發(fā)現AEG-1在高轉移性癌細胞系中高表達，而AEG-1的表達與人肝癌細胞系的定向趨化性和黏附性呈正相關。 Wei等[10]發(fā)現AEG-1可以作為致癌基因，抑制AEG-1的表達可以促進細胞凋亡，降低細胞活力并削弱前列腺癌細胞的侵襲能力。在胃癌的研究中發(fā)現，AEG-1可通過上調eIF4E/cyclin D1信號通路促進胃癌的生長[11]。在非小細胞肺癌的腫瘤發(fā)生和惡化中，AEG-1也被顯著激活，且可能通過AMPK信號通路發(fā)揮重要作用[12]。與上述研究相似，本研究發(fā)現AEG-1在子宮內膜癌組織中呈高表達，并與淋巴轉移和病理嚴重性顯著相關。表明AEG-1在子宮內膜癌發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，但其具體機制仍需在細胞水平進一步研究。

MMPs屬于蛋白水解酶，主要為細胞外基質分子的釋放，其可影響細胞外基質(ECM)組分受體細胞活性的某些方面功能，例如ECM降解、細胞增殖、黏附和遷移[13]。已有研究證實，MMP可調節(jié)和控制腫瘤血管生成，是腫瘤浸潤和轉移的重要因素[14]。MMP-9為MMPs家族重要一員，其可使基底膜中的膠原蛋白Ⅳ退化，以促進癌細胞侵襲和轉移[15]，且在一些腫瘤如膀胱癌和宮頸癌中具有預測預后價值[6-7]。因此，MMP-9可作為評估癌細胞浸潤、轉移情況的代表因子。本研究結果發(fā)現，子宮內膜癌組織中MMP-9蛋白表達量明顯增高,子宮內膜癌組織中AEG-1和MMP-9蛋白高表達與病理嚴重程度、淋巴轉移和浸潤均顯著相關，且AEG-1與MMP-9二者表達也呈現正相關性。Liu等[16]在乳頭狀甲狀腺癌研究中發(fā)現，敲低AEG-1會通過下調癌細胞中MMP-2/9表達而降低細胞的遷移和侵襲能力。綜上提示，AEG-1高表達可促進子宮內膜癌轉移和侵襲，AEG-1可能通過影響MMP-9表達調節(jié)子宮內膜癌轉移、侵襲過程。

β-catenin作為Wnt信號通路下游轉導分子，在很多研究中已被證實其活化可引起腫瘤的侵襲、轉移、增殖以及血管發(fā)生[17]。CUL4A 是新發(fā)現的CRLs泛素連接酶，位于癌基因高表達區(qū)域，參與癌細胞的遷移、侵襲過程[18]。因此，本研究同時檢測了子宮內膜癌組織中代表性侵襲基因表達情況，結果顯示，子宮內膜癌組織中β-catenin及CUL4A mRNA表達量均顯著增高，Pearson相關性分析發(fā)現AEG-1表達與β-catenin和CUL4A mRNA表達均呈顯著正相關，表明AEG-1的異常表達可直接影響子宮內膜癌細胞侵襲和轉移能力。

綜上所述，子宮內膜癌組織中存在AEG-1異常高表達，其可影響相關侵襲、轉移基因的表達及過程，從而影響子宮內膜癌的進展，但其具體作用機制仍需進一步研究證實。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。