林國(guó)鴻，羅強(qiáng)，農(nóng)文偉

（廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院 心胸腺體外科，廣西 南寧 530007）

0 引言

中國(guó)華南漢族早發(fā)性乳腺癌患者的BRCA1和BRCA2基因異常，在廣西地區(qū)散發(fā)性乳腺癌患者BRCA基因異常表達(dá)率高達(dá)為90.0%。在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[1]，在廣西崇左地區(qū)早發(fā)性乳腺癌患者復(fù)發(fā)中BRCA1和BRCA2表達(dá)降低可能崇左壯族早發(fā)性乳腺癌的發(fā)生，二者可能是乳腺癌的復(fù)發(fā)重要因素，尤其BRCA1的改變可能與其復(fù)發(fā)關(guān)系密切，但早發(fā)性乳腺癌BRCA1突變患者的復(fù)發(fā)機(jī)制尚未知。文獻(xiàn)報(bào)道，自噬可以促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與活性，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則抑制癌細(xì)胞的分化與增殖從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡[2]，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬-凋亡通路平衡調(diào)節(jié)與腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]，但在BRCA1突變的廣西崇左地區(qū)早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者中，此通路是否發(fā)生改變尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上，探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬-凋亡通路廣西崇左地區(qū)壯族早發(fā)性乳腺癌BRCA1突變復(fù)發(fā)患者中的表達(dá)變化情況。

1 資料與方法

1.1 資料采集及標(biāo)本分組

1.1.1 資料采集：本研究經(jīng)廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員批準(zhǔn)，術(shù)前簽署標(biāo)本處理知情同意書(shū)。收集2010年3月至2016年3月間我院收治的乳腺增生患者10例和早發(fā)性乳腺癌復(fù)發(fā)患者30例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①前期研究BCRA1基因表達(dá)降低；②女性患者年齡均≤35歲；③疾病最終診斷以術(shù)中切取病變組織進(jìn)行病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)，受試者均為浸潤(rùn)性非特殊癌；④臨床分期IIIb以下；⑤早發(fā)與復(fù)發(fā)均盡在本院治療；⑥復(fù)發(fā)時(shí)患者麻醉ASA評(píng)級(jí)III級(jí)以下。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非早發(fā)性復(fù)發(fā)乳腺癌；②病理診斷不符合浸潤(rùn)性非特殊癌；③臨床分期不符；④患者未簽署標(biāo)本處理同意書(shū)。納入研究的患者在組內(nèi)比較，年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、組織學(xué)類(lèi)型等方面無(wú)顯著性差異（P＜0.05）。

1.1.2 標(biāo)本分組：標(biāo)本經(jīng)術(shù)中外科切取或診斷穿刺無(wú)菌提取后液氮速凍后轉(zhuǎn)運(yùn)至-80攝氏度冰箱保存。乳腺增生患者乳腺組織為C組，復(fù)發(fā)患者的癌組織為A組,復(fù)發(fā)患者的癌旁組織為B組。

1.2 主要試劑。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白BIP（Immunoglob ulin heavy chain binding protein，免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白）購(gòu)自（Cell Signaling Technology公司，美國(guó)）；自噬相關(guān)蛋白 LC3（Microtubules associated protein light chain 3，微管相關(guān)蛋白輕鏈3）、P62和Bclin1及凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2和bax均購(gòu)自于英國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記鼠抗兔IgG（中杉金橋公司，中國(guó)）、酶標(biāo)鼠抗兔IgG（博士德公司，中國(guó)），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑混合物、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PVDF膜、考馬斯亮蘭R-250染液套裝、TEMED（碧云天公司，中國(guó)）。

1.3 Western blotting檢測(cè)。采用BCA法檢測(cè)各標(biāo)本的總蛋白濃度。采用煮沸5 min的方法使蛋白變性，十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上（均使用12.5%的SDSPAGE）。5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入BIP、LC3、beclin1，P62、bax、bcl-2一抗后4℃過(guò)夜后。復(fù)溫30 min后加入酶標(biāo)二抗，ECL法顯色，在Bio-Rad成像儀，獲取蛋白顯色后條帶，Image Lab軟件進(jìn)行條帶灰度值測(cè)量，計(jì)算為各個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激表達(dá)結(jié)果。與C組比較，A組和B組的ERS相關(guān)蛋白BIP表達(dá)水平均降低（均P＜0.05）；與A組比較，B組的BIP則表達(dá)增加（均P＜0.05）。各組標(biāo)本的BIP蛋白比較詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組標(biāo)本中BIP的相對(duì)表達(dá)量比較

2.2 自噬表達(dá)結(jié)果。在蛋白表達(dá)水平，與C組比較，A組和B組的LC3II/I、beclin1表達(dá)增加，P62表達(dá)降低（均P＜0.05）；與A組比較，B組的LC3II/I、beclin1表達(dá)降低，P62表達(dá)增加（均P＜0.05）。各組自噬相關(guān)蛋白比較詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組標(biāo)本中LC3-II/I、beclin1、P62的相對(duì)表達(dá)量比較

2.3 凋亡表達(dá)結(jié)果。在蛋白表達(dá)水平，與C組比較，A組和B組的凋亡相關(guān)蛋白bcl-2表達(dá)升高，bax表達(dá)下降（均P＜0.05）；與A組比較，B組的凋亡相關(guān)蛋白bcl-2表達(dá)升高，bax表達(dá)下降（均P＜0.05）。各組凋亡相關(guān)蛋白比較詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組標(biāo)本中bcl2、bax的相對(duì)表達(dá)量比較

3 討論

乳腺癌患者復(fù)發(fā)的最主要因素是區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處臟器轉(zhuǎn)移，而B(niǎo)CL2L2、CCNA1、CD44、CTSD和MAP2K7等基因的改變促進(jìn)了乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[4-5]，但處于基因突變下腫瘤的復(fù)發(fā)機(jī)制尚不清楚。在本研究中，提取前期研究篩選BRCA1基因低表達(dá)的廣西崇左地區(qū)早發(fā)性復(fù)發(fā)乳腺癌患者的乳腺癌組織與癌旁組織進(jìn)行蛋白免疫印跡分析。結(jié)果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平降低，自噬程度提升，凋亡水平降低（P＜0.05），此通路的改變可能是受試患者發(fā)生復(fù)發(fā)的機(jī)制之一。

綜上可知，乳腺癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖，而自噬會(huì)降低乳腺癌細(xì)胞的凋亡水平，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬-凋亡通路的平衡調(diào)節(jié)對(duì)癌細(xì)胞的耐藥、增殖、分化和轉(zhuǎn)移發(fā)揮促進(jìn)作用。在本研究中，廣西崇左地區(qū)壯族早發(fā)性BRCA1突變復(fù)發(fā)患者的癌組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平降低，自噬水平增加，凋亡程度減弱，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激-自噬-凋亡通路可能參與了其發(fā)生發(fā)展。本研究將為本地區(qū)的早發(fā)性BRCA1突變復(fù)發(fā)患者疾病防治及機(jī)制研究提供參考。