劉蕾 朱錦明 李亞楠 彭鳳云

1徐州醫(yī)科大學研究生院（江蘇徐州221006）；2徐州婦幼保健院（江蘇徐州221009）

人類基因KL 定位于染色體13q12，由5 個外顯子組成，其翻譯產(chǎn)物蛋白具有膜型和分泌型2種亞型［1］。分泌型Klotho 蛋白（sKL）主要分布于血液中，少量存在于尿液和腦脊液中［2］，其以體液因子的形式存在于循環(huán)系統(tǒng)中，人體缺乏KL 蛋白可表現(xiàn)為內(nèi)皮功能障礙、動脈硬化及血管生成受損等。KUSABA 等［3］證實KL 與VEGR2 和瞬時受體潛在的canonical-1 Ca2+通道相關，以維持內(nèi)皮細胞的完整性。

胎兒生長受限（fetal growth restriction，F(xiàn)GR）是圍產(chǎn)期死亡的第二大最常見原因［4］。2019年ACOG發(fā)布的FGR實踐指南將FGR定義為：估計胎兒體重（estimated fetal weight，EFW）低于相應胎齡第10 百分位數(shù)以下的胎兒［5］。FGR 胎兒的圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡率以及長期健康缺陷的風險較正常胎兒更高，然而FGR目前缺乏有效的治療方法，早期診斷、篩查高危因素，成為防治重點。目前關于FGR 發(fā)病原因及發(fā)病機制無明確定義，其中胎盤功能不全與FGR 的發(fā)病有著密切聯(lián)系，本實驗將通過檢測FGR 孕婦血清、胎盤組織中KL 蛋白及VEGFR2的表達水平，研究其表達水平差異是否影響正常胎盤血管網(wǎng)的形成及其對血管功能的影響，推測其在FGR 發(fā)生發(fā)展中的可能作用，以期為FGR 的病因提供新的思路，為預測FGR 的發(fā)生及評估孕婦胎盤功能提供新的方向，以及為FGR 治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2019年1月-2020年6月在徐州醫(yī)科大學附屬徐州婦幼保健院產(chǎn)科住院分娩的FGR 患者60 例。納入標準：（1）符合相關診斷標標準；（2）產(chǎn)婦及其家屬均自愿簽署知情同意書。排除標準：（1）自身免疫缺陷等疾病；（2）多胎妊娠；（3）伴嚴重肝腎等重要器官障礙性疾??；（4）受染色體和/或先天性異常影響的孕婦；（5）產(chǎn)前篩查提示胎兒可能存在發(fā)育異常；（6）父母雙方身材矮小或有家族性FGR 病史，另選擇同期正常孕晚期孕婦30 例作為對照組，對照組病例排除內(nèi)外科合并癥和產(chǎn)科并發(fā)癥。其中，F(xiàn)GR 患者60 例，根據(jù)診斷時的孕周，將其分為：早發(fā)型FGR30 例（發(fā)病孕周＜32 周）；晚發(fā)型FGR30 例（發(fā)病孕周≥32周）［6-9］。3 組均為單胎妊娠。3 組間平均年齡、孕次、產(chǎn)次差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），分娩孕周之間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。研究對象均征求本人書面同意并經(jīng)徐州醫(yī)科大學附屬徐州婦幼保健院倫理委員會同意（批準號：徐州市婦幼保健院［2020］倫審第（01）號）。

表1 三組孕婦一般情況比較Tab.1 The general situation of pregnant women in three groups was compared±s

表1 三組孕婦一般情況比較Tab.1 The general situation of pregnant women in three groups was compared±s

注：與正常妊娠對照組相比，*P ＜0.05

分組 總例數(shù) 年齡（歲） 孕次 產(chǎn)次 分娩孕周正常妊娠對照組3028.50±4.422.06±1.200.90±0.8839.00±1.26*早發(fā)型FGR晚發(fā)型FGR F值P值30 30 30.96±5.13 30.20±6.09 1.725 0.184 2.16±1.46 1.93±1.28 0.235 0.791 0.90±0.79 0.61±0.81 1.012 0.368 36.50±2.40 37.53±1.94*12.654＜0.001

1.2 ELISA 法檢測sKL、sVEGFR2所有的入組的研究對象均于入院后當日抽取肘靜脈血4 mL，離心，留取上清液，應用ELISA 方法檢測血清中sKL、sVEGFR2 的表達水平。

1.3 免疫組化檢測胎盤組織中KL、VEGFR2采用免疫組化SP 二步法檢測胎盤組織中KL、VEGFR2，一抗為兔抗人單克隆KL 抗體（英國Abcam 公司）、VEGFR2 單克隆抗體（英國Abcam 公司）嚴格按照試劑盒說明書步驟操作。根據(jù)陽性細胞百分率和細胞染色強度確定Klotho 及VEGFR2 的表達水平。參照FROMOWITZ 等［10］的綜合計分法進行半定量分析，根據(jù)陽性細胞分布范圍和染色強度確定蛋白的表達水平。以胞膜或胞質(zhì)出現(xiàn)明顯的棕黃色顆粒為陽性細胞，無著色或與背景顏色一致的為陰性細胞。陽性細胞百分數(shù)：≤5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～49%為2 分，≥50%為3 分；陽性細胞著色強度：無著色為0 分，淺棕褐色為1 分，棕褐色為2 分，深褐色為3 分；兩項評分相加：0～1 分為陰性，＞1 分為陽性。

1.4 Western blot 檢測胎盤KL、VEGFR2 蛋白量表達用蛋白提取試劑盒提取組織蛋白，并用BCA 法進行蛋白定量。配制SDS-PAGE 凝膠，電泳；切膠，電轉(zhuǎn)，脫脂牛奶封閉液室溫封閉2 h，放入KL 單抗（1∶1 000）、VEGFR2 單抗（1∶1 000）孵育過夜，洗膜，加入相應二抗（1∶5 000）孵育；洗滌后曝光，以β-actin 作為內(nèi)參照。蛋白的相對表達量用待測蛋白與β-actin 的灰度值比值計算。

1.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）測定胎盤KL mRNA、VEGFR2 mRNA 的表達量采用Trizol 法處理組織樣品，提取總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。后進行聚合酶鏈式反應（PCR）擴增，目的基因KL 引物序列，上游：5′-CTGGATGGTATCAATCTTTGCG-3′，下游：5′-ATCTGCAGCATAACGATAGAGG-3′，目的基因VEGFR2 引物序列，上游：5′-GGAGCTTAAGAATGCATCCTTG-3′，下游：5′-GATGCTTTCCCCAATACTTGTC-3′，目的基因擴增30個循環(huán)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參對照，計算相對含量。最后通過2-△△CT法計算各組表達水平的倍數(shù)差異。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。檢驗數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性后，計量數(shù)據(jù)以計算，多個樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料使用例數(shù)或（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 檢測結(jié)果結(jié)果顯示FGR 組孕婦血清中sKL、sVEGFR2 表達低于正常妊娠對照組（P＜0.05），其中早發(fā)型FGR 組和晚發(fā)型FGR 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 三組孕婦外周血中sKL、VEGFR2 的表達量Tab.2 Expression levels of sKlotho and VEGFR2 in peripheral blood of three groups of pregnant women x±s，pg/mL

2.2 免疫組化結(jié)果結(jié)果顯示KL蛋白主要表達于胎盤合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜、細胞質(zhì)及胎盤血管內(nèi)細胞中（圖1），VEGFR2 主要表達于胎盤血管內(nèi)皮細胞中（圖2）。FGR 組中KL、VEGFR2 蛋白表達低于正常妊娠對照組（P＜0.05），其中，早發(fā)型和晚發(fā)型差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

圖1 KL 在胎盤組織中的表達（DAB 染色，×400）Fig.1 Expression of KL in placental tissues（DAB staining，×400）

2.3 三組孕婦胎盤組織中KL、VEGFR2 蛋白及mRNA 表達水平FGR 組中KL mRNA、VEGFR2 mRNA 及蛋白表達水平均低于正常妊娠對照組（P＜0.05），其中早發(fā)型FGR 組和晚發(fā)型FGR 組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖3。

3 討論

KL 基因編碼α-Klotho、β-Klotho 及KL 相關蛋白，通過轉(zhuǎn)錄形成兩種轉(zhuǎn)錄本：一種是全長，該轉(zhuǎn)錄本可翻譯為由1 012 個氨基酸組成的分子量為130 kD 的跨膜蛋白，即膜型；另外一種轉(zhuǎn)錄本可翻譯為N 端的549 個氨基酸，分子量為65～70 kD 的分泌型蛋白［11］。血液循環(huán)中的KL蛋白由膜型KL蛋白經(jīng)水解產(chǎn)生的胞外區(qū)片段和分泌型KL 蛋白組成。缺乏KL 蛋白會影響內(nèi)皮細胞的完整性，其表達與血管鈣化、動脈粥樣硬化、腎病及腫瘤等多種疾病有關。在成人中，血管內(nèi)皮生長因子（VEGFs）是胚胎發(fā)育和血管形成過程中血管發(fā)育的重要調(diào)節(jié)因子。已有研究表明，在哺乳動物中，存在幾個不同的剪接變體和加工形式的五種VEGF 配體，這些配體以重疊的模式結(jié)合三種酪氨酸激酶受體（RTKs），即VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3，以及共受體，如硫酸肝素蛋白多糖（HSPGs）等［12］，sVEGFR2是一種免疫激活受體，由內(nèi)皮細胞表面蛋白水解形成，伴隨配體誘導下VEGFR2 的形成，在刺激新血管發(fā)生與生長以及維持血管壁的完整性和正常通透性方面均有重要意義。KUSABA 等［8］證實VEGF 介導的Ca2+信號通路通過與KL 的相互作用而受到嚴格的調(diào)控，并且KL 在VEGF 介導的血管活動以及內(nèi)皮功能的維持中發(fā)揮重要作用。

圖3 三組孕婦胎盤組織中KL mRNA 及VEGFR2 mRNA 的表達Fig.3 Expression of KL mRNA and VEGFR2 mRNA in placental tissues of three groups of pregnant women

宮內(nèi)生長受限常伴有胎盤血管疾病，胎盤功能異常導致的胎盤灌注不良是FGR 最常見的病因［13］，主要表現(xiàn)為胎盤血管建立不全、胎盤滋養(yǎng)細胞侵入功能障礙，影響子宮螺旋小動脈生理性重鑄，使胎盤血流量減少，從而影響胎兒血供。與正常妊娠胎兒胎盤相比，F(xiàn)GR 胎兒胎盤病理形態(tài)學改變?yōu)樘ケP體積縮??；鏡下病理改變表現(xiàn)為絨毛內(nèi)間質(zhì)增生、鈣化，纖維素樣壞死增多；絨毛內(nèi)血管減少甚至消失，管腔狹窄，甚至閉塞［14］。以上改變導致胎盤血流不足，交換面積減少，限制了氧及營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和轉(zhuǎn)運，是造成FGR 胎盤功能減退的形態(tài)學基礎［15］。在KL 蛋白與妊娠相關疾病中，現(xiàn)有研究表明，與正常妊娠相比，子癇前期胎盤KL mRNA 和蛋白表達降低，子癇前期產(chǎn)婦血清中KL降低［16-17］。FRANKLIN 等［18］報道稱KL蛋白在小于胎齡兒（small for gestational age infants，SGA）臍血及中表達下降，并與血管生成素2 相關，可能在血管介導的胎盤衰老加速導致的宮內(nèi)生長受限中發(fā)揮作用，另有研究觀察到，與正常出生體重組相比，巨大兒妊娠胎盤中KL 基因表達較高［19］。FGR 同妊娠期高血壓與妊娠期糖尿病等妊娠并發(fā)癥一樣，都有著胎盤血管及微循環(huán)的改變，推測KL 蛋白可能通過調(diào)控胎盤血管生成，影響胎盤循環(huán)，從而參與與胎盤血管病變相關的一系列妊娠并發(fā)癥的病理生理改變。

本研究結(jié)果顯示KL 蛋白主要定位于胎盤合體滋養(yǎng)細胞的細胞膜與細胞質(zhì)及胎盤血管內(nèi)皮細胞中，而VEGFR2 主要定位于胎盤血管內(nèi)皮細胞中，從蛋白及mRNA 水平上均顯示KL、VEGFR2 表達在FGR 組中低于正常妊娠對照組（P＜0.05），而在早發(fā)型FGR 與晚發(fā)型FGR 中，KL、VEGFR2 的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），同時在FGR 組的胎盤病理切片中觀察到了程度不同的血管灌注不足，終末絨毛血管形成欠佳、纖維素樣壞死缺血，絨毛間質(zhì)纖維化，合體結(jié)節(jié)增多，及小灶狀梗死、鈣化。因此筆者推測KL 蛋白與VEGFR2 相互作用，影響正常胎盤血管形成和發(fā)育，造成胎盤異常病理改變，從而導致胎盤血流進一步減少，胎盤發(fā)育不良，血管鈣化、微絨毛數(shù)量和密度明顯減少，阻礙母兒營養(yǎng)交換，從而導致FGR 的發(fā)生。ELISA檢測結(jié)果顯示FGR 組孕婦血清中sKL 及sVEGFR2的含量低于對照組（P＜0.05），其中早發(fā)型FGR組與晚發(fā)型FGR 組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），推測sKL 可能作為一種體液調(diào)節(jié)因子，與VEGFR2共同作用，通過體液循環(huán)，最終作用于胎盤，調(diào)控胎盤血管生長，sKL 蛋白表達減少，導致血管鈣化，胎盤血管功能受損，胎兒營養(yǎng)缺乏，進而發(fā)展為FGR。早發(fā)型FGR 組與晚發(fā)型FGR 組雖差異無明顯統(tǒng)計學意義（P＜0.05），但早發(fā)型FGR 孕婦外周血清中sKL 蛋白含量的均值低于晚發(fā)型FGR，有研究［20］表明早發(fā)型FGR 胎盤螺旋動脈重構(gòu)缺陷，周圍缺氧干擾絨毛發(fā)育，胎盤效率降低較晚發(fā)型FGR更常見，早發(fā)型FGR可能存在更早期的胎盤血管功能障礙，較晚發(fā)型FGR 在病理生理上表現(xiàn)的更為典型，本次研究的孕周為孕晚期，而在孕晚期早發(fā)型FGR 孕婦及晚發(fā)型FGR 孕婦均已形成胎盤不可逆的病理改變，這可能是造成KL 與VEGFR2的表達在孕婦胎盤及血清中表達無明顯差異的原因。

綜上所述，本研究表明KL 蛋白、VEGFR2 蛋白在FGR 孕婦母體血清及胎盤中的表達量降低，提示KL 蛋白可能與VEGFR2 共同作用參與FGR 的發(fā)生發(fā)展，推測KL 通過與VEGFR2 相互作用，調(diào)節(jié)胎盤血管內(nèi)皮功能，從而影響胎盤胎兒循環(huán)。KL 與VEGFR2 具體在胎盤血管上的作用機制有待進一步研究，可以從細胞水平探討KL 與VEGFR2在胎盤血管形成上的相互作用機制，本文局限于孕晚期研究，可進一步追溯FGR 孕婦孕早期及孕中期，以期為FGR 的預測、預防提供一個新的靶點，以便于最大程度降低FGR 母兒風險。