田祖國 高陸 劉水玉 翁春嵐

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院血液內(nèi)科（貴州遵義563000）

彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin′s lymphoma，NHL）最常見的類型，其發(fā)病率占NHL 31% ～34%［1］，我國DLBCL 的發(fā)病率更高，統(tǒng)計顯示我國DLBCL 占所有淋巴瘤的40.1%，占NHL 的45.8%［2］。聯(lián)合免疫化療顯著改善DLBCL 療效［3］，但由于DLBCL 具有高度異質(zhì)性，仍有約40%的DLBCL 患者表現(xiàn)復(fù)發(fā)耐藥導(dǎo)致治療失敗，而尋找新的靶標對DLBCL 的診療具有重要意義［4］。UFC1（ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1，UFC1）是一個新鑒定的類泛素結(jié)合酶E2，有研究顯示其在乳腺癌組織中明顯高表達［5］。本研究應(yīng)用免疫組化方法（immunohistochemical，IHC）檢測DLBCL中UFC1 的表達情況，并聯(lián)合應(yīng)用多個生物數(shù)據(jù)庫研究UFC1 在DLBCL 中的表達情況，分析UFC1 表達與DLBCL 的臨床特征、生存預(yù)后的相關(guān)性，為DLBCL 的臨床診療提供新的依據(jù)和潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 組織標本免疫組化

1.1.1 標本收集收集遵義醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)附屬醫(yī)院病理資料，篩選病例資料相對完整的40 例初治DLBCL 和20 例反應(yīng)性淋巴結(jié)炎的病理組織石蠟標本，采用IHC 法檢測UFC1 表達情況，組織標本均取自淋巴結(jié)腫塊。納入標準：（1）病理學(xué)明確診斷為DLBCL；（2）有完整的整體評估資料，包括ECOG 評分、LDH、影像檢查、IPI 評分等；（3）完成規(guī)范的DLBCL 化療療程。排除標準：（1）非DLBCL 的其他類型淋巴瘤及腫瘤；（2）無完整的臨床資料；（3）未治療或者治療不規(guī)范者。其中男性26 例，女性14 例；年齡≥60 歲19 例，＜60 歲21 例；AnnArbor分期Ⅰ-Ⅱ期8 例，Ⅲ-Ⅳ期32 例；ECOG 評分＜2 分25 例，≥2 分15 例；有B 癥狀16 例，無B 癥狀 的24 例；有結(jié)外浸潤22 例，無結(jié)外浸潤的18 例；IPI評分0 ～1 分10 例，2 分18 例，3 分10 例，4 ～5 分2 例。實驗研究方案經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會審核。

1.1.2 主要試劑Anti-UFC1 antibody（Ab-cam，ab189252），免疫顯色試劑盒EnVisionTMFLEX+，Mouse，HighpH，（Link），DAKO，K800211）。

1.1.3 免疫組化染色石蠟切片按En Vision 兩步法染色，由2 名病理科醫(yī)師讀片判斷，采用免疫組化染色評分（immunoreactive score，IRS）進行判定，以陽性細胞數(shù)評分加染色強度評分之和進行綜合評分。0 ～1 分為陰性，用（-）表示；2 ～3 分為低表達，用（+）表示；4 ～5 分為中表達，用（++）表示；6 ～7 分為高表達，用（+++）表示；（+）-（+++）均視為陽性表達。

1.2 GEPIA數(shù)據(jù)庫利用GEPIA數(shù)據(jù)庫［6］（GEPIA，http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html）分析UFC1 在DLBCL 和正常組織中的差異表達，分析步驟：（1）Expression DIY 板塊中選擇Boxplot；（2）Gene 輸入UFC1；（3）Datasets Selection 選擇DLBC；（4）LogScale 選擇否；（5）其余參數(shù)選項為默認。

1.3 GEO 數(shù)據(jù)集在GEO 數(shù)據(jù)庫［7］（GEO，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中檢索篩選DLBCL 數(shù)據(jù)集，分析UFC1 的差異表達，及UFC1 表達與DLBCL臨床特征及生存預(yù)后相關(guān)性。

1.3.1 GSE9327 數(shù)據(jù)集GSE9327數(shù)據(jù)集［8］檢測了反應(yīng)性淋巴結(jié)炎（reactive lymphadenitis）和淋巴瘤基因表達差異，包含8 例反應(yīng)性淋巴結(jié)炎和38例套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）、38例慢性淋巴細胞白血?。╟hronic lymphocytic lymphoma，CLL）、9 例伯基特淋巴瘤（burkitt′s lymphoma，BL）、27 例脾邊緣區(qū)淋巴瘤（splenic marginal zone lymphoma，SMZL）、36 例彌漫大B 細胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）及33 例濾泡淋巴瘤（follicular lymphoma，F(xiàn)L）；應(yīng)用該數(shù)據(jù)集分析UFC1 在反應(yīng)性淋巴結(jié)炎和包括DLBCL 的淋巴瘤中的表達變化。

1.3.2 GSE10846 數(shù)據(jù)集GSE10846數(shù)據(jù)集［9］包含采用R-CHOP 方案治療233 例DLBCL 的UFC1 基因表達值及患者的性別、年齡、臨床分期、結(jié)外浸潤及生存時間等臨床信息。基于該數(shù)據(jù)集探討UFC1 表達與DLBCL 臨床特征及生存預(yù)后相關(guān)性。

1.4 OSdlbcl 數(shù)據(jù)庫運用OSdlbcl 數(shù)據(jù)庫［10］（OSdlbcl，http：//bioinfo.henu.edu.cn/DLBCL/DLBCLList.jsp）檢索UFC1 表達與DLBCL 預(yù)后關(guān)系。分析步驟：（1）Gene symbol：UFC1；（2）Data Source：TCGA；（3）Survival：PFS，OS；（4）Split patients by：Upper 50%；（5）其余參數(shù)均選擇All。

1.5 Linkedomics 數(shù)據(jù)庫應(yīng) 用Linkedomics 數(shù)據(jù) 庫［11］（LinkedOmics，http：//linkedomics.org）分 析DLBCL 中UFC1 的共表達基因及GSEA 富集分析。分析步驟：（1）腫瘤類型為TCGA_DLBC；（2）選擇RNAseq 數(shù)據(jù)；（3）輸入基因名稱UFC1；（4）目標分析數(shù)據(jù)為RNAseq；（5）選擇Pearson Correlation檢驗。

1.6 String-DB 數(shù)據(jù)庫運 用String 數(shù)據(jù) 庫［12］（String，https：//string-db.org）分析UFC1 蛋白互作關(guān)系。分析步驟：（1）輸入基因：UFC1；（2）物種：Homo sapiens；（3）置信度：Medium 0.4；（4）最大相互作用：20。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0 進行統(tǒng)計分析，組織UFC1 免疫組化結(jié)果采用秩和檢驗；數(shù)據(jù)集GSE9327 基因表達差異分析采用Graphpad Prism 8.0 分析及作圖；數(shù)據(jù)集GSE10846 資料臨床特征分析采用卡方檢驗；生存分析采用Graphpad Prism 8.0 分析及作圖；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織免疫組化組織染色顯示UFC1主要在細胞質(zhì)中陽性表達，部分細胞核有少量陽性表達。UFC1 蛋白在40 例DLBCL 和20 例reactive lymphadenitis 組織中IHC 檢測呈+、++、+++表達的鏡下表現(xiàn)如下（圖1）。DLBCL中UFC1蛋白呈-、+、++、+++者分別為0、4、16、20 例；反應(yīng)性淋巴結(jié)炎中UFC1 蛋白呈-、+、++、+++者分別為3、14、2、1 例；UFC1 表達在DLBCL 和反應(yīng)性淋巴結(jié)炎中差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001，表1）。

圖1 淋巴結(jié)組織中UFC1 蛋白的表達（10×40）Fig.1 Positive Expression of UFC1 protein in lymph node samples（10×40）

表1 UFC1 表達在DLBCL 和反應(yīng)性淋巴結(jié)炎中的表達Tab.1 UFC1 expression in patients with DLBCL and Reactive lymphadenitis例

2.2 數(shù)據(jù)庫中UFC1 在淋巴瘤中的表達

2.2.1 GEPIA 檢索UFC1 在DLBCL 中的表達GEPIA 結(jié)果顯示47 例DLBCL 和337 例正常組織的UFC1 表達明顯差異，DLBCL 中UFC1 表達異常升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2）。

圖2 GEPIA 在線分析顯示DLBCL 中UFC1 表達顯著高于正常組織Fig.2 UFC1 expression in DLBCL was significantly higher than normal tissues by GEPIA analysis

2.2.2 GEO 數(shù)據(jù)庫中UFC1 的表達GSE9327 數(shù)據(jù)集分析顯示，與反應(yīng)性淋巴結(jié)炎相比，在DLBCL中UFC1 基因表達明顯升高（P＜0.0001），同時在MCL、MZL、CLL、BL 中，UFC1 基因表達也明顯升高，但在濾泡淋巴瘤中表達不升高（圖3）。

圖3 GSE9327 數(shù)據(jù)集分析顯示UFC1 在DLBCL、MCL、MZL、CLL、BL 中呈高表達Fig.3 UFC1 is highly expressed in DLBCL，MCL，MZL，CLL and BL in GSE9327

2.3 UFC1 表達與DLBCL 的臨床特征相關(guān)性GSE10846 數(shù)據(jù)集分析顯示在DLBCL 患者中，UFC1在大于60 歲老年患者（P= 0.003）和non-GCB 型DLBCL 中表達更高（P= 0.015），而在患者性別、LDH、結(jié)外浸潤、臨床分期及ECOG 評分中差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表2）。

2.4 UFC1 表達與DLBCL 預(yù)后相關(guān)性

2.4.1 GEO 數(shù)據(jù)庫分析GSE10846 數(shù)據(jù)集分析顯示UFC1 高表達的DLBCL 患者總生存期（overall survival，OS）明顯差于UFC1 低表達患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0326，圖4）。

表2 GSE10846 中UFC1 表達與DLBCL 患者臨床病理特征的關(guān)系Tab.2 Association between UFC1 expression and clinicopathological characteristics in GSE10846例（%）

圖4 GSE10846 分析顯示UFC1 高表達的DLBCL 患者OS較差Fig.4 The OS of DLBCL patients with high expression of UFC1 was inferior（P=0.032 6）in GSE10846

2.4.2 OSdlbcl中檢索UFC1表達與DLBCL預(yù)后相關(guān)性在線數(shù)據(jù)庫OSdlbcl 中檢索結(jié)果顯示UFC1高表達的DLBCL 患者的無進展生存期（progression free survival，PFS）差于UFC1低表達患者（P=0.015 9），同樣的UFC1 高表達DLBCL 患者其OS 也比較差（P= 0.0325），提示DLBCL 患者UFC1 高表達者預(yù)后不良（圖5）。

圖5 OSdlbcl 分析顯示高表達UFC1 與DLBCL 預(yù)后不良相關(guān)，其PFS（A）、OS（B）均較短Fig.5 High expression of UFC1 indicate poor prognosis in patients with DLBCL according to OSdlbcl.Patients with high expression of UFC1 had shorter PFS（A）and OS（B）

2.5 UFC1共表達基因分析Linkedomics分析顯示，1 779個基因（暗紅點）與UFC1呈正相關(guān)，2 478個基因（暗綠點）與UFC1 呈負相關(guān)（false discovery rate，F(xiàn)DR ＜0.01，圖6A）。與UFC1正相關(guān)和負相關(guān)的前50個顯著基因熱圖顯示（圖6B、C）。UFC1共表達基因GO（Gene Ontology，GO）分析（圖6D）顯示主要涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白定位、核糖體基因表達、線粒體呼吸鏈復(fù)合體、NADH 脫氫酶復(fù)合體翻譯啟動及翻譯延伸、細胞膜蛋白定位等；KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析顯示（圖6E）其主要富集在核糖體、氧化磷酸化、蛋白酶體、及癌癥miRNA、Hedgehog信號通路、JAK-STAT信號通路等。

圖6 DLBCL 中的UFC1 共表達基因分析結(jié)果Fig.6 UFC1 co-expression gene analysis in DLBCL

2.6 UFC1蛋白互作分析String數(shù)據(jù)庫檢索UFC1的PPI 分析結(jié)果（富集系數(shù)為0.803；P值為8.22 ×10-15）顯示（圖7）：與UFC1 相互作用密切的包括：PCMT1、COX17、UFSP1、UFSP2、USP34、USP9X、YKT6、SPR、TYMS、UBA3、UBA5、UFL1、ATP6V1B2等。

3 討論

DLBCL 是NHL 中最常見的類型，聯(lián)合免疫化療明顯提高了DLBCL 患者的生存預(yù)后，但仍然有相當一部分患者疾病復(fù)發(fā)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）介導(dǎo)細胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶體降解，可高效并高選擇性地降解細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，如細胞周期調(diào)節(jié)蛋白、癌基因和抑癌基因產(chǎn)物等，與血液系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［13］；如UBCH10 在霍奇金淋巴瘤、彌漫性大B 細胞淋巴瘤、外周T 細胞淋巴瘤及伯基特淋巴瘤中均過度表達［14］。自1975年發(fā)現(xiàn)泛素和20 世紀80年代初發(fā)現(xiàn)泛素級聯(lián)以來，許多泛素樣蛋白（UBLs）被鑒定為翻譯后修飾因子，目前已經(jīng)鑒定出17 種9 大類的類泛素蛋白：包括NEDD8、SUMO、ISG15、FUB1、FAT10、Atg8、Atg12、Urm1 和UFM1 等；研究顯示類泛素蛋白Atg8（或LC3）與介導(dǎo)細胞自噬相關(guān)，涉及Atg7、Atg3、Atg12/5/16L、Atg4A 等，研究顯示LC3 與Atg5 相互協(xié)同促進胃癌發(fā)生發(fā)展［15］，而Atg4A 的過表達促進胃癌細胞的EMT 作用，增強胃癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［16］；而以NEDD88 為靶點的酶抑制劑Pevonedistat 在淋巴瘤細胞中具有抗腫瘤活性，臨床研究也提示其在復(fù)發(fā)難治淋巴瘤治療有效［17］。

UFC1 定位于1 號染色體，為新鑒定的類泛素結(jié)合酶E2，屬于類泛素Ufm1 修飾系統(tǒng)（ubiquitinfold modifier 1，Ufm1）。研究發(fā)現(xiàn)UFC1 在乳腺癌組織和細胞系中高表達［18］，而沉默UFC1 抑制了乳腺癌細胞的多種生物學(xué)活性，UFC1 可以通過miR-34a/CXCL10 軸調(diào)控乳腺癌的生物學(xué)活性［19］。提示UFC1 基因與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系。

本研究首先通過IHC 檢測顯示UFC1 蛋白在DLBCL 中表達明顯高于反應(yīng)性淋巴結(jié)炎（P＜0.001）；進一步的GEO 數(shù)據(jù)驗證發(fā)現(xiàn)UFC1 不僅在DLBCL 患者中表達明顯升高，同時在其他惡性淋巴瘤包括BL、MZL、MCL 及CLL 中均呈明顯高表達。

圖7 UFC1 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.7 UFC1 protein interaction network

進一步的GEO 數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)UFC1 表達與DLBCL 患者年齡和Hans 分型相關(guān)，在老年患者和non-GCB 類型的DLBCL 中表達更高，而與DLBCL患者的性別、結(jié)外浸潤、臨床分期、ECOG 評分及LDH 表達未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。而已有的研究已經(jīng)明確老年的DLBCL 患者和non-GCB 類型患者預(yù)后均相對不佳，推測UFC1 的異常表達可能與DLBCL患者預(yù)后相關(guān)。通過GEO 數(shù)據(jù)集GSE10846 分析證實UFC1 的表達與DLBCL 患者預(yù)后是相關(guān)的，UFC1 高表達患者的OS 明顯差于UFC1 低表達患者（P= 0.0326）；而OSdlbcl 數(shù)據(jù)庫檢索分析也證實了UFC1 高表達的DLBCL 患者PFS（P=0.0159）、OS（P=0.0325）均明顯差于UFC1 低表達患者，提示高表達UFC1 的DLBCL 患者預(yù)后不良。

UFC1 共表達基因富集分析結(jié)果與核糖體、氧化磷酸化及多種腫瘤癌癥通路相關(guān)，而研究顯示核糖體、氧化磷酸化等與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，均可能為新的腫瘤治療潛在靶點［20-21］。UFC1蛋白互作分析顯示其與其與多種腫瘤標志物密切相關(guān)，包括PCMT1、COX17、UFSP1、UFSP2、USP34、USP9X、DDRGK1、YKT6、SPR、TYMS、UBA3、UBA5、UFL1、ATP6V1B2 等，而已有研究顯示PCMT1、USP9X、UBA5、DDRGK1 等［22-25］與腫瘤發(fā)生、發(fā)展明顯相關(guān)，是腫瘤的潛在治療靶點。

根據(jù)以上研究分析結(jié)果，UFC1 在DLBCL 淋巴瘤中表達異常增高，在老年患者和non-GCB 患者中表達升高明顯，高表達UFC1 的DLBCL 患者預(yù)后不良，UFC1 與多種腫瘤相關(guān)基因及腫瘤通路密切相關(guān)，有可能成為淋巴瘤的潛在治療靶點。