魯進(jìn) 尹伶 黃漢平

1武漢科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院（武漢430081）；2鄂州市第三醫(yī)院感染科（湖北鄂州436000）；3武漢市金銀潭醫(yī)院結(jié)核科（武漢430023）

肺結(jié)核是一種由結(jié)核分枝桿菌感染肺部引起的慢性感染性疾病，患者會(huì)出現(xiàn)咳嗽、咳血、體質(zhì)量下降等癥狀，治療不及時(shí)會(huì)危及生命［1］。調(diào)查顯示，全世界人口中感染過結(jié)核分枝桿菌的人占1/3，其中大部分感染者沒有特異性的臨床癥狀，約5% ～10%的感染者不經(jīng)過治療會(huì)發(fā)展為肺結(jié)核［2-3］。WHO 相關(guān)數(shù)據(jù)表明，全球每年結(jié)核病患者人數(shù)達(dá)800 ～1 000 萬例，死亡人數(shù)達(dá)300 萬人，死亡率在非復(fù)合傳染病中位居第一［4］。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)的免疫效應(yīng)細(xì)胞及免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，能吞噬病原體、分泌細(xì)胞因子并活化其他免疫細(xì)胞［5］。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞是結(jié)核分枝桿菌在機(jī)體內(nèi)的主要存活地，結(jié)核分枝桿菌可通過調(diào)控巨噬細(xì)胞的功能保證自身存活［6-7］。白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-6 是在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的炎癥細(xì)胞因子，可通過與受體結(jié)合將信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）磷酸化激活，繼而參與細(xì)胞內(nèi)的大量生物應(yīng)答［8］。另有研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌6-kDa 的早期分泌抗原靶點(diǎn)可以通過激活STAT3 刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6［9］。基于此，本研究將通過檢測(cè)IL-6、STAT3 在肺結(jié)核患者及巨噬細(xì)胞中的表達(dá)水平，初步探討其具體作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年10月至2019年10月在武漢市金銀潭醫(yī)院接受治療的肺結(jié)核患者92 例（觀察組）作為研究對(duì)象，男52 例，女40 例，年齡46 ～74 歲，平均年齡（59.73 ± 5.46）歲，診斷符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)制定的《肺結(jié)核診斷和治療指南》［10］，排除合并其他免疫缺陷疾病、其他臟器功能受損、惡性腫瘤、其他慢性疾病或近半年有過免疫治療的患者。選取同期健康體檢者95 例（對(duì)照組）作為對(duì)照，男50 例，女45 例，年齡48 ～74 歲，平均年齡（60.85 ± 5.65）歲。本研究通過本院倫理委員會(huì)審核，并所有研究對(duì)象簽署知情同意書。

1.2 試劑與儀器人巨噬細(xì)胞（貨號(hào)：PB-MDM-002F-C）購自澳賽爾斯生物技術(shù)（上海）有限公司；結(jié)核分枝桿菌（貨號(hào)：ZY-10850）購自上海澤葉生物科技有限公司；細(xì)胞裂解液（貨號(hào)：BB-3207）購自上海貝博-Bestbio；BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒（貨號(hào)：PA115-01）購自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清（貨號(hào)：FBS500-S）購自澳大利亞AusGeneX公司；DMEM 培養(yǎng)基（貨號(hào)：KL-P0032）購自德國merck/sigma 公司；STAT3 抗體、p-STAT3 抗體、核因子κB（nuclear factor kappaB，NF-κB）p65、p-NF-κB p65、GAPDH 抗 體（貨 號(hào)：ab109085、ab76315、ab16502、ab183559、ab181602）購自abcam 公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔（貨號(hào)：0295G-HRP）購自美國santa 公司；人IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（貨號(hào)：HL10458、HL10473、HL10038）購自上海哈靈生物科技有限公司；恒溫培養(yǎng)箱（型號(hào)：TY10GI2-2）購自美國Shellab 公司；酶標(biāo)儀（型號(hào)：MODEL550）購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平在晨間空腹?fàn)顟B(tài)下抽取兩組受試者外周靜脈血，分為兩份。一份加入裂解液裂解30 min，4 ℃10 000 r/min 離心10 min 獲得總蛋白，使用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進(jìn)行10%SDS-PAGE 凝膠電泳，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST 封閉2 h，加入p-STAT3 抗體、STAT3 抗體、p-NF-κB p65抗體、NF-κB p65 抗體、GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，TBST 洗膜，化學(xué)發(fā)光法顯色，凝膠成像系統(tǒng)顯影，拍攝圖像并分析條帶灰度，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4 ELISA 法檢測(cè)血清炎癥因子水平取另一份外周靜脈血，4 ℃3 000 r/min 離心10 min，取上層血清，嚴(yán)格按照ELISA 試劑盒說明書，采用ELISA 法檢測(cè)受試者血清IL-6、IL-10、TNF-α水平，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長處的吸光度（optical density，OD）值，配制標(biāo)準(zhǔn)液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)液吸光度結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)與分組將巨噬細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合至70% ～80%時(shí)傳代培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為兩組：正常組和感染組。正常組巨噬細(xì)胞不做處理，感染組巨噬細(xì)胞用結(jié)核分枝桿菌感染。

1.6 Western blot法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平將巨噬細(xì)胞以1×105個(gè)/mL 的密度接種于培養(yǎng)瓶，按1.2.3 分組處理，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解液裂解獲得細(xì)胞中總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，加入p-STAT3 抗體、STAT3 抗體、p-NF-κB p65 抗體、NF-κB p65 抗體、GAPDH 抗體（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，洗膜，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶3 000），室溫孵育1 h，洗膜，顯色、顯影、拍攝圖像、分析條帶灰度，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 ELISA 法檢測(cè)各組巨噬細(xì)胞上清液中炎癥因子水平將巨噬細(xì)胞以1 × 105個(gè)/mL 的密度接種于24 孔板，按1.2.3 分組處理，培養(yǎng)48 h，離心取上清液，ELISA 法檢測(cè)上清液中IL-6、IL-10、TNF-α水平，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長處的OD值，計(jì)算IL-6、IL-10、TNF-α水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)處理采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。當(dāng)P＜0.05 時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比，觀察組肺結(jié)核患者外周血中p-STAT3/STAT3、p-NF-κB p65/NF-κB p65 蛋白水平顯著升高（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 對(duì)照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood of subjects in control group and observation group

表1 對(duì)照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood between control group and observation group±s

表1 對(duì)照組、觀察組受試者外周血中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較Tab.1 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in peripheral blood between control group and observation group±s

組別 例數(shù)p-STAT3/STAT3p-NF-κB p65/NF-κB p65對(duì)照組950.42±0.090.54±0.13觀察組t 值P 值92 0.75±0.11 22.485＜0.001 0.95±0.14 20.761＜0.001

2.2 對(duì)照組、觀察組血清炎癥因子水平與對(duì)照組相比，觀察組肺結(jié)核患者血清中IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見表2。

2.3 正常組、感染組巨噬細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平與正常組相比，感染組巨噬細(xì)胞中p-STAT3/STAT3、p-NFκB p65/NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見圖2、表3。

圖2 正常組、感染組巨噬細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)情況Fig.2 Expression of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group

表2 對(duì)照組、觀察組受試者血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平比較Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-10 and TNF-α between the control group and the observation group ±s

表2 對(duì)照組、觀察組受試者血清中IL-6、IL-10、TNF-α水平比較Tab.2 Comparison of serum levels of IL-6，IL-10 and TNF-α between the control group and the observation group ±s

組別 例數(shù)IL-6（ng/mL）IL-10（ng/mL）TNF-α（pg/mL）對(duì)照組9533.59±2.56237.03±10.8877.61±6.95觀察組9282.16±4.74366.92±10.64172.35±7.87 t 值P 值87.559＜0.001 82.507＜0.001 87.327＜0.001

2.4 正常組、感染組巨噬細(xì)胞上清液中炎癥因子水平與正常組相比，感染組巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），見表4。

3 討論

肺結(jié)核的發(fā)病與免疫功能有關(guān)，免疫功能長期低下的人群更容易并發(fā)肺結(jié)核，而肺結(jié)核的主要免疫機(jī)制與細(xì)胞免疫有關(guān)［11］。肺結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌感染肺部引發(fā)的傳染性疾病，其致死性僅次于艾滋病，結(jié)核分枝桿菌感染后，巨噬細(xì)胞會(huì)分泌大量的細(xì)胞因子，將淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞活化，進(jìn)而殺滅結(jié)核分枝桿菌［12］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，盡管全球1/3 左右的人感染過結(jié)核分枝桿菌，其中發(fā)展為肺結(jié)核的感染者僅占5% ～10%，這種現(xiàn)象也表明患者機(jī)體的免疫系統(tǒng)在控制結(jié)核分枝桿菌感染方面發(fā)揮了重要作用［2］。然而，巨噬細(xì)胞作為基礎(chǔ)免疫細(xì)胞，在吞噬、滅殺結(jié)核分枝桿菌的同時(shí)，由于結(jié)核分枝桿菌感染后作用于巨噬細(xì)胞的一系列機(jī)制，導(dǎo)致對(duì)結(jié)核分枝桿菌殺傷力降低，同時(shí)給結(jié)核分枝桿菌在人體內(nèi)的長期存活提供了有利環(huán)境［13-14］。為了提高感染結(jié)核分枝桿菌后的免疫功能，深入了解肺結(jié)核患者巨噬細(xì)胞免疫的具體機(jī)制具有重要意義。

表3 正常組、感染組巨噬細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group ±s

表3 正常組、感染組巨噬細(xì)胞中p-STAT3、STAT3、p-NF-κB p65、NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平比較Tab.3 Comparison of protein expression levels of p-STAT3，STAT3，p-nf-κB p65 and NF-κB p65 in macrophages of normal group and infection group ±s

組別p-STAT3/STAT3p-NF-κBp65/NF-κBp65正常組0.36±0.070.79±0.07感染組t 值P 值0.82±0.09 9.882＜0.001 0.93±0.08 3.226 0.009

表4 正常組、感染組巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)水平比較Tab.4 Comparison of expression levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in macrophage supernatant of normal group and infection group ±s

表4 正常組、感染組巨噬細(xì)胞上清液中IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)水平比較Tab.4 Comparison of expression levels of IL-6，IL-10 and TNF-α in macrophage supernatant of normal group and infection group ±s

組別IL-6（pg/mL）IL-10（pg/mL）TNF-α（pg/mL）正常組176.02±12.48535.82±20.07245.44±13.55感染組t 值P 值285.69±14.31 14.1480＜0.001 794.56±20.56 22.058＜0.001 374.12±16.79 14.609＜0.001

IL-6 是一種由巨噬細(xì)胞及T 淋巴細(xì)胞分泌的具有促炎作用的白細(xì)胞介素，參與免疫反應(yīng)，是STAT3 經(jīng)典的上游激活因子，可以改變STAT3 蛋白質(zhì)構(gòu)象，促進(jìn)STAT3 磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB 信號(hào)通路，調(diào)控炎癥細(xì)胞因子表達(dá)［15-16］。IL-10 是常見的抑炎因子，可抑制炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生及抗原特異性T 細(xì)胞的激活［17］。TNF-α是常見的促炎因子，在免疫性肝損傷過程中受到NF-κB 信號(hào)通路的調(diào)控［18］。HARLING 等［19］研究表明，與健康接觸者相比，結(jié)核病患者IL-6、IL-10 表達(dá)水平均顯著升高，可能是由致病細(xì)胞因子引起的。本研究結(jié)果顯示，觀察組肺結(jié)核患者外周血中STAT3 磷酸化、NF-κB磷酸化蛋白水平及血清中IL-6、IL-10、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高，提示肺結(jié)核患者外周血中炎癥反應(yīng)平衡紊亂，促炎、抑炎機(jī)制均被激活。

巨噬細(xì)胞在肺結(jié)核發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。一方面，作為免疫系統(tǒng)中的基礎(chǔ)免疫細(xì)胞，在病原菌結(jié)核分枝桿菌感染后攻擊、吞噬結(jié)核分枝桿菌，或激活細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)，誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子釋放及T 淋巴細(xì)胞聚集，增強(qiáng)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的攻擊作用［20］。另一方面，結(jié)核分枝桿菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，可誘導(dǎo)泡沫巨噬細(xì)胞形成，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的表型、功能均發(fā)生改變，不僅降低了對(duì)結(jié)核分枝桿菌的吞噬、殺傷能力，還會(huì)抑制抗結(jié)核分枝桿菌特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生［21］。本研究采用結(jié)核分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞中STAT3 磷酸化、NF-κB 磷酸化蛋白表達(dá)水平及IL-6、TNF-α表達(dá)水平均顯著升高，提示巨噬細(xì)胞被結(jié)核分枝桿菌感染后可能分泌IL-6，促進(jìn)STAT3 蛋白磷酸化，進(jìn)而激活NF-κB 蛋白，導(dǎo)致炎癥因子TNF-α水平升高，同時(shí)，結(jié)核分枝桿菌通過誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分泌IL-10 抑制免疫反應(yīng)，以保證自身存活［22］。

綜上所述，肺結(jié)核患者外周血及感染結(jié)核分枝桿菌的巨噬細(xì)胞上清液中IL-6 表達(dá)水平升高，可能通過促進(jìn)STAT3 蛋白磷酸化激活NF-κB 通路，提高免疫反應(yīng)。