陳希妍 馬彥娟 牛麗丹 楊亞琴 楊飛云 石金河

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急診科（河南衛(wèi)輝453100）

miRNA 是一類長(zhǎng)度為19～25 nt 的非編碼單鏈小分子RNA，在心臟重塑、血管細(xì)胞收縮、心肌收縮以及脂質(zhì)代謝等心血管疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用［1-2］。miRNA-155 與動(dòng)脈粥樣硬化存在著密切關(guān)系［3］，并且其還參與心肌細(xì)胞損傷，下調(diào)miRNA-155 水平可減輕心肌細(xì)胞損傷程度［4］。以往的研究［5-6］顯示，Notch 信號(hào)通路參與缺氧/復(fù)氧所誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)液通過Notch2/mTOR/自噬信號(hào)途徑保護(hù)心肌細(xì)胞免受缺氧/復(fù)氧損傷［7］。miRNA-381 通過抑制Notch 信號(hào)通路負(fù)性調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞存活［8］。研究顯示Notch 信號(hào)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬發(fā)揮細(xì)胞的保護(hù)作用［9］，而抑制miRNA-155 表達(dá)可通過上調(diào)自噬作用減輕氧化損傷，促進(jìn)細(xì)胞增殖［10］。miRNA-155 是否是通過對(duì)Notch1 信號(hào)通路的影響而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用，還未見報(bào)道。本研究以H9C2 細(xì)胞為研究對(duì)象，建立缺糖缺氧細(xì)胞模型，檢測(cè)miRNA-155 與Notch1 信號(hào)通路及細(xì)胞自噬，凋亡的關(guān)系，將為臨床心肌細(xì)胞缺血、缺氧的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞大鼠心肌細(xì)胞H9C2 細(xì)胞株購自于協(xié)和細(xì)胞庫

1.2 主要試劑miRNA-155 inhibitor、轉(zhuǎn)染試劑體LipofectamineTM2000，購自于蘇州吉瑪基因公司。Notch1 抗體，HES1 抗體購自于SANTA Cruz 公司，Beclin1 抗體，cleaved-Caspase-3 抗體購自于Abcam公司，GAPDH 抗體購自于Sigma 公司

1.3 心肌細(xì)胞的培養(yǎng)H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基中（含100 U/mL 青霉素及0.1 mg/mL 鏈霉素），置于37 ℃、5 % CO2的恒溫培養(yǎng)箱中，2～3 d 傳代1 次，實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。

1.4 缺氧缺糖細(xì)胞模型的建立及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組將H9C2細(xì)胞正常培養(yǎng)（37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)）24 h后，更換成不含血清的低糖DMEM 培養(yǎng)基低氧條件下（1%O2、95%N2、5%CO2）培養(yǎng)24 h。正常對(duì)照組，缺氧缺糖組（OGD group），缺氧缺糖+陰性對(duì)照miRNA-155 inhibitor 組（轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照miRNA-155 inhibitor 后缺氧缺糖條件培養(yǎng)24 h）（OGD +miRNA-155 inhibitor negative control group），缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 組（轉(zhuǎn)染miRNA-155 inhibitor 后缺氧缺糖條件培養(yǎng)24 h）（OGD + miRNA-155 inhibitor group）。

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)miRNA-155 mRNA 的表達(dá)分別提取正常對(duì)照組與OGD 組心肌細(xì)胞總RNA，利用RT-qPCR 檢測(cè)兩組細(xì)胞中miRNA-155 mRNA的表達(dá)變化，（miRNA-155-F CGCGTTAATGCTAATCGTGAT；miRNA-155-R CGCGTTAATGCTAATCGTGAT），按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，RT-qPCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃30 s，變性94 ℃5 s、退火56 ℃30 s、延伸72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。

1.6 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照轉(zhuǎn)染試劑的使用說明，利用轉(zhuǎn)染試劑分別將miRNA-155 inhibitor ，陰性對(duì)照miRNA-155 轉(zhuǎn)染至H9C2 細(xì)胞中。

1.7 Western blot 檢測(cè)細(xì)胞中Notch1，HES1 及Beclin1，cleaved-Caspase-3的表達(dá)變化收集正常對(duì)照組，缺氧缺糖組（OGD group），缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 陰性對(duì)照組與缺氧缺糖+miRNA-155 inhibitor 組細(xì)胞，利用RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。常規(guī)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，Notch1 抗體（1∶500），HES1 抗體（1∶500），Beclin1抗體（1∶500），cleaved-Caspase-3 抗體（1∶1 000）及GAPDH 抗體（1∶10 000）4 ℃孵育過夜，熒光Ⅱ抗（1∶1 000）室溫孵育2 h 后，Odyssey 曝光，Image J 軟件分析灰度值。

1.8 心肌細(xì)胞活性的檢測(cè)將H9C2 按照5 × 103的密度接種于96 孔板中，按照上述方法將細(xì)胞分為4 組，在缺氧缺糖誘導(dǎo)24 h 后檢測(cè)各組活性，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，正常培養(yǎng)條件下繼續(xù)孵育3 h，酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)OD值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩樣本數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，多樣本數(shù)據(jù)比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 正常對(duì)照組與OGD組心肌細(xì)胞中miRNA-155 mRNA 的表達(dá)變化利用RT-qPCR 檢測(cè)了2 組細(xì)胞中miRNA-155 mRNA 的表達(dá)情況，結(jié)果如圖1 所示，與正常組相比較，OGD 組心肌細(xì)胞中miRNA-155 mRNA 的表達(dá)顯著升高（P＜0.01）。

圖1 利用RT-qPCR 檢測(cè)miRNA-155 mRNA 在2 組細(xì)胞中的表達(dá)Fig.1 The expression of miRNA-155 mRNA in two groups was detected by RT-qPCR

2.2 Notch1、HES1、Beclin1、Caspase-3 在各組細(xì)胞中的表達(dá)情況利用Western blot 檢測(cè)了正常對(duì)照組、OGD 組、OGD+miRNA-155inhibitor 陰性對(duì)照組及OGD + miRNA-155 inhibitor 組心肌細(xì)胞中Notch1、HES1、Beclin1、cleaved-Caspase-3 蛋白的表達(dá)情況（圖2），與正常對(duì)照組相比較，OGD 組心肌細(xì)胞中的Notch1、HES1 蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.01），而Beclin1 與cleaved-Caspase-3 蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.001）；與OGD 組相比較，轉(zhuǎn)染miRNA-155 inhibitor 后，心肌細(xì)胞中的Notch1，HES1 及Beclin1 蛋白的表達(dá)顯著升高（P＜0.05），而cleaved-Caspase-3 蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.01）。提示miRNA-155 負(fù)向調(diào)節(jié)Notch1 信號(hào)通路的激活，促進(jìn)細(xì)胞自噬，抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

圖2 Western blot 檢測(cè)Notch1、HES1、Beclin1、cleaved-Caspase-3 蛋白在4 組細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 The expression of Notch1，HES1，Beclin1and cleaved-Caspase-3 in four groups was detected by Western blot

2.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組心肌細(xì)胞的活性CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，OGD 組細(xì)胞的活性顯著降低（P＜0.01）；而與OGD 組相比較，轉(zhuǎn)染miRNA-155 inhibitor 后，細(xì)胞的活性則顯著升高（P＜0.05），miRNA-155 inhibitor 陰性對(duì)照組細(xì)胞的活性差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3），這就提示在缺氧缺糖情況下，抑制miRNA-155 后，通過促進(jìn)Notch1 信號(hào)的激活，提高心肌細(xì)胞的活性。

3 討論

急性心肌梗死（acute myocardial infraction，AMI）是由于血栓或冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的急性改變引發(fā)冠狀動(dòng)脈閉塞，導(dǎo)致心肌細(xì)胞嚴(yán)重缺血缺氧的心血管疾?。?1］，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。microRNAs 是一類在許多生物學(xué)過程中是必不可少的非編碼的RNA，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中起著關(guān)鍵作用［12-14］。作為一種多功能的miRNA，miRNA-155 不僅在腫瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮作用［15］，更有研究顯示其在心腦血管疾病中發(fā)揮重要作用［10］，miRNA-155 表達(dá)減弱可減輕氧化損傷，通過上調(diào)細(xì)胞自噬促進(jìn)細(xì)胞增殖［10］。miRNA-155 異常表達(dá)對(duì)腦缺血產(chǎn)生顯著影響，其可通過Notch 信號(hào)通路對(duì)腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生影響［16］，而其在心肌細(xì)胞的缺血缺氧損傷中的作用機(jī)制還不清楚。

圖3 各組心肌細(xì)胞的活性。Fig.3 The viability of cells in each group

本研究通過建立心肌細(xì)胞缺血缺氧模型，檢測(cè)miRNA-155 在心肌細(xì)胞中的表達(dá)變化，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比較，模型組細(xì)胞中miRNA-155 的表達(dá)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

越來越多的研究表明，Notch 信號(hào)通路心血管疾病中發(fā)揮著心肌細(xì)胞保護(hù)作用［17-18］，孔令宇等［9］的研究顯示，Notch 信號(hào)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬發(fā)揮細(xì)胞細(xì)胞的保護(hù)作用。本研究通過抑制miRNA-155的表達(dá)檢測(cè)缺糖缺氧的心肌細(xì)胞中Notch1、HES1、自噬相關(guān)蛋白Beclin1、Caspase-3 蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，抑制miRNA-155 的表達(dá)后，缺糖缺氧的心肌細(xì)胞中Notch1，HES1，自噬相關(guān)蛋白Beclin1 的表達(dá)均顯著升高，而Caspase-3 蛋白的表達(dá)顯著下降；CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比較，抑制miRNA-155 的表達(dá)后，心肌細(xì)胞的活性顯著升高。

綜上所述，在缺血缺氧條件下，抑制miRNA-155 的表達(dá)可促進(jìn)Notch 信號(hào)通路的激活，促進(jìn)心肌細(xì)胞自噬，減少細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞的損傷，增強(qiáng)細(xì)胞活性，從而發(fā)揮對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。