（遼寧省檢驗檢測認(rèn)證中心，遼寧沈陽 110036）

微生物菌種是我國非常重要的生物資源，也是我國自然資源寶庫的重要組成部分，對生產(chǎn)和研究有著舉足輕重的作用。隨著微生物菌種被越來越多的應(yīng)用到食品、飼料、醫(yī)藥等領(lǐng)域，其活性和穩(wěn)定性顯得越來越重要，因此對菌種保藏的要求也越來越高[1]。本文結(jié)合筆者多年一線食品微生物檢驗、食品安全風(fēng)險監(jiān)測陽性菌株鑒定、復(fù)核、分型及藥敏試驗等相關(guān)工作經(jīng)驗及相關(guān)文章文獻(xiàn)，對常見微生物菌種保藏方法的優(yōu)劣進(jìn)行比較，以期為微生物檢驗或保藏機(jī)構(gòu)提供參考。

1 菌種保藏基本原理

微生物菌種保藏的方法不少，原理也是相差無幾，基本都是依據(jù)微生物的種類和繁殖的生理生化特性不同，通過對溫度、濕度、氧氣等條件的控制，達(dá)到微生物生長代謝活動受到抑制，生長繁殖暫時處于休眠的狀態(tài)，既保證菌種不死、不衰、不變，又使其代謝處于最低狀態(tài)，同時保持菌種本身應(yīng)有的特性。好的保藏方法既要考慮方法的經(jīng)濟(jì)性，又要考慮到簡便性，以利于在生產(chǎn)和工作中方便應(yīng)用[2]。應(yīng)根據(jù)不同菌種的特點以及需求，選擇合適的保藏方法。

2 微生物菌種常用保藏方法

2.1 定期移植法[3]

此方法有時也稱為傳代培養(yǎng)法，該方法是一般微生物實驗室經(jīng)常使用的保藏方法之一（如圖1、圖2 所示）。根據(jù)不同微生物生長繁殖所需條件的不同，將需要保藏的菌種接種至適宜的斜面或者液體培養(yǎng)基中，在適當(dāng)溫度條件下培養(yǎng)至所需時間，生長充分以后，于4℃～6℃條件下保存，保藏時間一般為4 個月～6 個月，隔一段時間進(jìn)行一次傳代培養(yǎng)。應(yīng)注意對于副溶血性弧菌等弧菌不可采用冷藏方法進(jìn)行保藏。

圖1 傳代培養(yǎng)法

此方法的優(yōu)點是操作不復(fù)雜，觀察方便，且對人員要求不高，一般微生物從業(yè)人員均可順利完成，是微生物檢測的基礎(chǔ)操作?；静恍枰厥鈨x器設(shè)備，成本較低，應(yīng)用范圍廣。但缺點是工作強(qiáng)度大，無法保存較長時間，需要頻繁進(jìn)行傳代移植，而且在移植過程中極易造成污染和菌種的退化。

圖2 瓊脂斜面保藏法

2.2 礦物油保藏法[4,5]

此方法有時也稱為液體石蠟保藏法，是定期移植保藏法的輔助方法。通常將液體石蠟滅菌后封蓋培養(yǎng)物表面，防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)的同時也起到隔絕空氣的作用來抑制微生物的生長繁殖，使其處于休眠狀態(tài)。應(yīng)注意在保藏中要定期進(jìn)行檢查，確保液面始終高于培養(yǎng)基。

此方法的優(yōu)點是保存時間相對較長，可達(dá)到2 年～10 年，并且操作簡單，使用方便，對于很多真菌的保藏也適用。但缺點是對人員操作水平有一定要求，且操作強(qiáng)度大，成本高。在使用礦物油時要注意防止污染和防范火災(zāi)，且直立的試管需要對存放空間有較高要求，攜帶十分不便。

2.3 真空冷凍干燥保藏法[6,7]

此方法是指將需要保藏的菌種細(xì)胞或孢子懸浮于保護(hù)劑中，經(jīng)預(yù)凍后在真空條件下使水分升華，再經(jīng)過真空封存后進(jìn)行保存的保藏方法。此方法可克服簡單保藏方法的不足?？沙浞掷脤N保藏的有利因素，使微生物菌種始終處于低溫、干燥、缺氧的條件下，因而它是時至今日最有效的菌種保藏法之一。此方法的原理是將冷凍的培養(yǎng)物在減壓狀態(tài)下進(jìn)行真空干燥，使菌種處于不利于其生長繁殖的環(huán)境。對于好氧菌和厭氧菌的保藏，主要操作程序基本相同，但需要注意保護(hù)劑的選擇。

此方法的優(yōu)點是保存期限長，可達(dá)到10 年以上，且攜帶、運輸方便，菌種的存活率和穩(wěn)定性均較高。缺點是對設(shè)備要求高，需要專業(yè)的冷凍真空干燥設(shè)備，投入相對較高；對人員操作水平要求高，操作方法相對繁瑣，通常專業(yè)化的菌種保藏機(jī)構(gòu)選用此種方法；冷凍干燥過程對菌體有一定損傷，需進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。

2.4 載體保藏法[6,8]

此方法又稱為干燥保藏法。一般會依據(jù)選擇載體的不同，最常采用沙土管、明膠片、濾紙保藏法。對于產(chǎn)孢子或有芽孢的霉菌和放線菌都可以用這種方法進(jìn)行保藏。

此方法的優(yōu)點是操作簡便，所需儀器設(shè)備簡單，而且便于攜帶。缺點是對營養(yǎng)細(xì)胞不適用，使用范圍相對較窄。

2.5 液氮冷凍保藏法[9]

此方法有時也稱為液氮超低溫凍結(jié)保藏法。將懸浮于保護(hù)劑中的菌種經(jīng)程控降溫后，移至-196℃的液氮或-150℃的液氮氣相中保存的方法。方法要求配備一些專用設(shè)備，如液氮冰箱、液氮儲藏器等，需要使用甘油、吐溫80 等保護(hù)劑。此方法適用于支原體、衣原體等采用冷凍干燥法難以保藏的菌種，是很多菌種保藏機(jī)構(gòu)選擇較多的方法。

此方法優(yōu)點是菌種保藏時間較長，菌種存活率高，且不易發(fā)生變異及退化。但缺點是操作相對復(fù)雜，對人員操作水平要求高；設(shè)備昂貴，需要定期補(bǔ)充液氮，保藏成本高。同時需注意防爆危險的發(fā)生。

2.6 -80℃冰箱凍結(jié)法

此方法是將菌種懸浮于保護(hù)劑中置于-80℃冰箱凍結(jié)保存的一種長期保藏菌種的方法，一般可保藏2 年～5 年。

此方法的優(yōu)點是使用較方便且保存時間較長。缺點是不利于運輸和攜帶，對設(shè)備要求較高，需要配備-80℃的低溫冰箱。

3 結(jié)束語

關(guān)于微生物菌種保藏的新方法不斷涌現(xiàn)，需要根據(jù)菌種的不同特性進(jìn)行選擇。我國對于微生物菌種保藏的研究起步相對較晚，科研基礎(chǔ)相對薄弱，需要業(yè)內(nèi)人員積極努力探索找尋更有利于推廣的保藏技術(shù)，在保證菌種特性穩(wěn)定的基礎(chǔ)上探索更經(jīng)濟(jì)更便捷的保藏方法[10-13]。