張 新，李雅萍，尹 東，張 佐

牙髓炎是口腔科臨床中重要的疾病之一，好發(fā)于各年齡段群體中，男女發(fā)病并無明顯差異，發(fā)病后會(huì)對(duì)患者的身心健康造成嚴(yán)重影響，降低患者的生活質(zhì)量[1]。人體牙髓組織中，含有間充質(zhì)干細(xì)胞，其具有自我增殖和分化的能力，若牙髓復(fù)合體受損，牙髓細(xì)胞可以發(fā)揮出修復(fù)和保護(hù)的作用[2]。至今，牙髓細(xì)胞對(duì)于牙髓復(fù)合受損的作用已經(jīng)獲得共識(shí)，但其作用機(jī)制并未明確。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)在牙髓細(xì)胞的遷移過程中，扮演著非常重要的角色，是重要的調(diào)控性因子，參與到了反應(yīng)性牙本質(zhì)的修復(fù)[3]。有研究指出[4]，TGF-β1可抑制牙髓細(xì)胞的增殖，且這一作用是通過調(diào)控p38 MAPK信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)[5]，在細(xì)胞的增殖和遷移過程中，胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/分裂原激活蛋白激酶(ERK/MAPK)信號(hào)通路起著介導(dǎo)性的作用。目前，臨床關(guān)于TGF-β1對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖和分化能力的研究并不少見，但是是否通過調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖和分化能力的報(bào)道并不多見。為此，本研究納入我院收治的急性牙髓炎患者、慢性牙髓炎和牙髓組織正常者各45例，針對(duì)TGF-β1調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)人牙髓細(xì)胞增殖和分化能力的影響進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1 一般資料：選取我院口腔科2019年6月-12月收治的急性牙髓炎患者45例、慢性牙髓炎患者45例和牙髓檢查正常者45例視為研究對(duì)象，分別收集各組患者或受檢者的牙髓組織標(biāo)本,各組基本資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 TGF-β1表達(dá)檢測(cè)：采用Western blot法檢測(cè),即取各組牙髓組織中100 g 蛋白，裂解蛋白酶提取總蛋白，通過BCA試劑盒對(duì)其濃度進(jìn)行檢測(cè);獲取結(jié)果后調(diào)整濃度，上樣進(jìn)行電泳后4 ℃轉(zhuǎn)膜，5%牛血清白蛋白溶液(BSA)封閉2 h，將一抗(羊抗TGF-β1單克隆抗體)和二抗(羊抗鼠IgG)加入其中，調(diào)整孵育溫度至37 ℃，持續(xù)孵育2 h。

1.2.2 TGF-β1增殖能力檢測(cè)：采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè),即取傳代一致的牙髓細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞濃度進(jìn)行調(diào)整至1×105，然后接種于96孔板中(200 μl/孔);將DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)24 h，更換無血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行24 h饑餓處理，再分別更換成含濃度為0.1、0.5、2.0、5.0 μl的TGF-β1的DMEM培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置只加DMEM的對(duì)照組，間隔2 h進(jìn)行一次培養(yǎng)基更換。在培養(yǎng)1、3、5、7 d 時(shí)，加入CCK-8溶液至每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀對(duì)各組0D值進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 TGF-β1通過調(diào)控ERK/MAPK信號(hào)通路促進(jìn)牙髓細(xì)胞增殖作用的檢測(cè)：參照1.2.3實(shí)驗(yàn)方法，總共分為4個(gè)組：①對(duì)照組；②TGF-β1(5.0 μg/L)處理組；③TGF-β1(5.0 μg/L)+U0126(10 μmol/L)處理組；④U0126(10 μmol/L)處理組。

2結(jié)果

2.1 ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖的影響：TGF-β1組細(xì)胞培養(yǎng)至第3、5和第7天時(shí)，OD490值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，TGF-β1+U0126組和U0126組的OD490值低于對(duì)照組和TGF-β1組(P<0.05)，見表1。

2.2 ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞分化的影響：TGF-β1組細(xì)胞培養(yǎng)至第3、5和第7天時(shí)，堿性磷酸化酶活性顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，活性越高。TGF-β1+U0126組和U0126組的細(xì)胞ALP活性顯著低于對(duì)照組和TGF-β1組(P<0.05)，見表2。

表1 ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖的影響

表2 ERK/MAPK信號(hào)通路對(duì)TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞分化的影響

3討論

ERK/MAPK是細(xì)胞中非常重要的一種信號(hào)通路，與細(xì)胞的各個(gè)生理過程，如增殖、遷移、分化等密切相關(guān)[6]。有研究指出[7]，在牙髓干細(xì)胞的增殖和分化過程中，ERK/MAPK信號(hào)通路扮演著重要的角色，可以起到增強(qiáng)的效果[8-9]。ERK/MAPK信號(hào)通路中，U0126是一種特異性抑制劑。本研究嘗試研究U0126對(duì)TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖和分化的影響，結(jié)果顯示TGF-β1組細(xì)胞培養(yǎng)至第3、5和第7天時(shí)，OD490值顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。TGF-β1+U0126組和U0126組的OD490值顯著低于對(duì)照組和TGF-β1組(P<0.05)。因此，U0126在TGF-β1調(diào)控牙髓細(xì)胞增殖和分化的過程中發(fā)揮著抑制作用。

進(jìn)一步分析TGF-β1對(duì)ERK/MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PPAR-γ、ELK-1表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β1在其中發(fā)揮著促進(jìn)作用，提示了ERK/MAPK信號(hào)通路參與到了TGF-β1誘導(dǎo)的牙髓細(xì)胞增殖過程[10-11]。堿性磷酸化酶是一種正磷酸甲酯磷酸水解酶，其活性會(huì)隨著環(huán)境的變化而變化，進(jìn)而影響細(xì)胞的礦化和骨組織的形成[12]。目前，國(guó)內(nèi)外口腔科醫(yī)學(xué)研究者，普遍認(rèn)為在牙髓組織中，堿性磷酸化酶可以作為牙髓細(xì)胞向牙本質(zhì)分化的早期標(biāo)志物[13]。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1組細(xì)胞培養(yǎng)至第3、5和第7天時(shí)，堿性磷酸化酶活性顯著高于對(duì)照組義(P<0.05)，培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，活性越高。TGF-β1+U0126組和U0126組的細(xì)胞ALP活性顯著低于對(duì)照組和TGF-β1組(P<0.05)，提示了TGF-β1可能顯著增加堿性磷酸化酶活性，而U0126能夠降低堿性磷酸化酶的活性。