候 燕，孫 媛

孕婦煙草暴露已被證實是多種不良妊娠結(jié)局的危險因素[1]。研究資料顯示，孕婦在孕前與孕期長時間與煙霧接觸會增加流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎等發(fā)生風(fēng)險。除此之外孕婦在孕前、孕期主動或被動吸煙，出現(xiàn)胎兒畸形、生長受限及低出生體重、神經(jīng)精神系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等疾病的概率大大增加[2-3]。有研究報道，孕婦在妊娠早期吸煙可能造成絨毛缺氧，同時可能影響血管生成和細胞凋亡[4]。煙草煙霧中含有的多種致癌物質(zhì)和細胞毒性化學(xué)物質(zhì)共同介導(dǎo)慢性炎癥及破壞性重塑事件等機體反應(yīng)。現(xiàn)階段，煙草煙霧對成人的生理和病理的分子機制研究雖然相對較多，但具體機制仍不清晰。相比之下，人們對煙草暴露對孕婦及胚胎發(fā)育影響的機制更是知之甚少。本研究通過生物信息學(xué)方法分析妊娠期間吸煙和不吸煙婦女胎盤組織的轉(zhuǎn)錄譜，探究孕期煙草暴露對孕婦機體作用的機制。

1資料與方法

1.1 一般資料：本研究從公共基因芯片數(shù)據(jù)平臺GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數(shù)據(jù)庫中搜索到基因芯片數(shù)據(jù)集GSE71931，芯片共包含4例樣本，其中包含孕期吸煙2個孕婦樣本及對照組2個樣本，其芯片平臺是GPL13158 [HT_HG-U133_Plus_PM] Affymetrix HT HG-U133+ PM Array Plate。

1.2 差異基因(DEGs)的篩選：通過GEO2R分析，設(shè)定篩選條件P<0.05，logFC絕對值>1.0，將得到的差異基因去重，并刪除無對應(yīng)名稱的基因片段，篩選差異表達基因。

1.3 DEGs的GO和KEGG分析：本研究通過DAVID(The Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery v6.8，https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫在線分析提供所需的GO生物功能富集數(shù)據(jù)和KEGG通路分析，以發(fā)現(xiàn)差異表達的基因可能參與的生物學(xué)通路[6-7]。使用Fisher Exact 或EASE Score 統(tǒng)計方法，GO各項和KEGG各項均以P<0.05為篩選條件[6]。

1.4 DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵基因篩選驗證：通過在線分析網(wǎng)站STRING得到DEGs的PPI網(wǎng)絡(luò)，把STRING網(wǎng)站的分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件[8-9](版本3.7.1)，分別應(yīng)用MCODE ( Molecular Complex Detection)插件和cytohubba 插件篩選出PPI中連接最為緊密的集簇和PPI網(wǎng)絡(luò)中處于關(guān)鍵位置的前10個hub基因，并應(yīng)用Genecards數(shù)據(jù)庫獲取hub genes的基本信息。

1.5 臨床研究對象：選取2018年2月-2019年2月于我院產(chǎn)科住院分娩的孕婦中選取10例既往有吸煙史并孕期存在煙草煙霧暴露的孕婦，相同時間段內(nèi)選取10例無吸煙史且周圍環(huán)境無煙草煙霧暴露的孕婦，獲得研究對象知情同意。納入標準：既往無嚴重急、慢性疾?。粏翁ト焉?，年齡>20歲。排除標準：伴有其它妊娠并發(fā)癥或合并癥；伴有近期用藥史、感染、長期飲酒史；合并重要臟器功能異常；合并自身免疫系統(tǒng)疾病、高血壓、糖尿病等疾病。

1.6 胎盤組織CDK6基因表達量檢測：胎盤娩出后，于胎盤母面中央無鈣化區(qū)域取出1 cm×1 cm×1 cm體積的胎盤組織，置于生理鹽水中清洗血液后，放入凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存。根據(jù)說明書提取患者胎盤組織中的RNA，采用Fast King cDNA第一鏈合成試劑盒將 RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。委托上海生工生物工程股份有限公司合成引物序列，采用TaKaRa公司的Real Time PCR反應(yīng)試劑盒，以上述制備的cDNA為模板配置PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 34 s，共40個循環(huán)。反應(yīng)在60 ℃時采集熒光信號，并用ABI7500 PCR儀自帶軟件進行熔解曲線分析，判斷是否存在引物二聚體和非特異性擴增產(chǎn)物。檢測CDK6的相對表達量，以β-actin表達量作為內(nèi)參，相對表達量采用2-ΔΔCT法計算。

2結(jié)果

2.1 差異表達基因篩選結(jié)果：本研究選用基因表達芯片GSE71931，共篩選出182個DEGs，其中135個mRNA表達上調(diào)，47個mRNA表達下調(diào)(FC≥2，P<0.05)。

2.2 GO和KEGG分析結(jié)果：采用DAVID數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行GO和KEGG信號通路富集分析其結(jié)果見表1。GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達基因主要定位在胞漿、胞膜、中心體區(qū)域；生物學(xué)過程主要涉及對藥物反應(yīng)、cAMP分解代謝過程、蛋白處理；分子功能主要涉及3 ′，5 ′-cAMP-磷酸二酯酶活性、抑制cGMP的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶活性、離子通道結(jié)合等；KEGG分析顯示差異表達基因主要和嘌呤代謝、嗎啡成癮等有關(guān)，見表1。

表1 與煙草暴露相關(guān)的DEGs的GO富集分析和KEGG分析

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果：將DEGs導(dǎo)入STRING和Cytoscape進行分析后得到PPI網(wǎng)絡(luò)(PPI enrichment P-value=0.00311)(見圖1A，目錄后)。本研究按degree為標準，最終篩選出處于關(guān)鍵位置的10個基因(見圖1B，目錄后)，分別為CDK6、SMARCA4、CKAP5、YWHAH、MCM7、CLIP4、ANK3、KIF3B、RUVBL1和ARL4C。應(yīng)用Genecards數(shù)據(jù)庫獲取這10個hub genes的基本信息，列于表2中，根據(jù)功能描述，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這幾個關(guān)鍵蛋白與細胞周期、骨架蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等功能有關(guān)。

此外，MCODE分析發(fā)現(xiàn)4組集簇，共包含49個節(jié)點(node)與88條連線(edge)。本研究以score為依據(jù)展示前2組集簇并分析各個集簇所富集的通路(圖2A、B，封三)，其中集簇模塊A富集嗎啡成癮通路(Morphine addiction pathway) (P<0.05)，參與cAMP分解代謝生物途徑 (cAMP catabolic process pathway) (P<0.05)，集簇模塊B富集細胞周期通路(Cell cycle pathway)(P>0.05)，參與核糖體大單位亞基合成生物途徑(P<0.05)。分析結(jié)果說明煙草暴露對孕婦作用的機制可能與藥物成癮和細胞周期通路相關(guān)。

表2 10個Hub基因詳細信息

2.4 CDK6基因表達結(jié)果：利用qRT-PCR檢測胎盤組織中CDK6的表達水平，見圖3(封三)。結(jié)果顯示非煙草暴露組孕婦胎盤組織中CDK6的表達水平顯著高于暴露組，非暴露組的表達量是暴露組表達量的2.27倍(P<0.05)，與芯片結(jié)果表達趨勢一致。

3討論

近年來，從基礎(chǔ)研究到臨床觀察多項證據(jù)顯示，孕婦煙草暴露是多種不良妊娠結(jié)局的危險因素。本研究課題側(cè)重于對孕婦胎盤組織的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，從而闡明煙草煙霧暴露獨特的和共同的基因組效應(yīng)，探究孕期煙草暴露對孕婦機體作用的關(guān)鍵基因，為下一步的機制研究提供參考。

本研究通過對GEO數(shù)據(jù)庫中的基因芯片GSE71931進行生物信息學(xué)分析獲得DEGs，并分析了有關(guān)這些基因富集的生物過程、細胞定位、分子功能和信號通路，篩選靶基因和關(guān)鍵集簇。研究結(jié)果顯示，煙草暴露出現(xiàn)的差異表達基因生物學(xué)功能主要涉及對藥物反應(yīng)、cAMP分解代謝過程、蛋白處理，和嘌呤代謝、嗎啡成癮等通路有關(guān)。與本研究不同的是，有報道吸煙者胎盤中與異種代謝、抗氧化基因、滋養(yǎng)細胞和血管化基因相關(guān)的基因表達上調(diào)，與離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因表達下調(diào)。也有研究顯示，吸煙不僅會產(chǎn)生自由基，而且還會消耗保護機體免受氧自由基有害影響的抗氧化系統(tǒng)，從而增加氧化應(yīng)激[10]。吸煙引起的胎兒重要生物分子氧化損傷的增加與100多種疾病的發(fā)病機制有關(guān)[11]。總之，煙草暴露可能是由多種機制介導(dǎo)的影響機體多組織的分子過程。目前關(guān)于此方面的研究尚不清晰，本課題可以為后續(xù)的機制研究提供參考。

通過蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)共篩選出CDK6、SMARCA4、CKAP5、YWHAH、MCM7、CLIP4、ANK3、KIF3B、RUVBL1和ARL4C共10個關(guān)鍵基因。其中CDK6屬于周期蛋白依賴性激酶家族成員，通過對絲氨酸/蘇氨酸蛋白的化學(xué)作用驅(qū)動細胞周期，和周期蛋白cyclin協(xié)同作用，是細胞周期調(diào)控中的重要因子[12]。本研究驗證了CDK6基因在煙草暴露組低表達，與基因芯片結(jié)果一致。此結(jié)果提示CDK可能是介導(dǎo)煙草內(nèi)多種化學(xué)物質(zhì)對機體作用的一個潛在靶點。SMARCA4是SWI/SNF復(fù)合體中一種重要的組成成分，通過改變核小體構(gòu)象從而調(diào)節(jié)基因表達。有研究顯示，SMARCA4對診斷卵巢高鈣血癥型小細胞癌具有高度的敏感性和特異性，并在卵巢差分化腫瘤的鑒別診斷中具有非常重要的臨床意義[13]。MCM7(微小染色體維持蛋白7)在細胞周期中作為DNA復(fù)制的準許因子，參與調(diào)節(jié)細胞增殖，研究發(fā)現(xiàn)MCM7基因的擴增和高表達與肝癌、肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤的發(fā)生及預(yù)后有關(guān)[14-16]。有關(guān)hub基因研究較少，有的則顯示不同程度的參與腫瘤等疾病的發(fā)生發(fā)展[17]。本課題篩選出的Hub genes，暫未有其與孕婦煙草暴露危害機制相關(guān)的文獻報道。由于煙草暴露效應(yīng)機制復(fù)雜，本研究所得到的結(jié)論尚需要更多的資料來進行驗證。