龍 乾，許賢瑞，燕 茹，劉 峰，張?zhí)氐埽瑥埜偽?/p>

同型半胱氨酸(Hcy)是由甲硫氨酸和半胱氨酸在代謝過程中產(chǎn)生的重要中間體[1]。在某些病理情況下，Hcy在血清中的濃度升高，引起高同型半胱氨酸血癥(HHcy)[1-2]。已有研究表明[2-4]，HHcy是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，能夠加重Alzheimer′s病等神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)功能損害，誘發(fā)腦卒中患者缺氧障礙。Notch/ Hes1信號通路能夠維持機(jī)體各種前體細(xì)胞的未分化狀態(tài)，具有促進(jìn)細(xì)胞分化方向選擇的作用[5-6]。但是，HHcy對神經(jīng)元的損傷及其Notch/Hes1信號通路的影響尚不清楚。本研究以高蛋氨酸飲食飼喂 ApoE-/-小鼠造成高同型半胱氨酸血癥模型，通過組織病理學(xué)、組織化學(xué)、原位末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸(dUTP)標(biāo)記法(TUNEL)觀察腦額葉區(qū)域的損傷變化，qPCR檢測Hes1 、Notch1的表達(dá)，探討HHcy時(shí)神經(jīng)細(xì)胞損傷以及Hes1、Notch1 mRNA的變化。

1資料與方法

1.1 一般資料：ApoE-/-小鼠，4周齡雄性24只，體重18～20 g，同周齡 C57/6J小鼠12只，均由寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。普通 AIN-93G 飼料和含 1.7% 蛋氨酸的 AIN-93G 飼料(上海薩博生物有限公司)為商品化產(chǎn)品。TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(羅氏公司)，DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 分組及模型制備：將ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為高同型半胱氨酸血癥實(shí)驗(yàn)組(HM)和ApoE-/-小鼠對照組(ApoE-/-)，每組12只；ApoE野生型c57/6J小鼠為空白對照組(Con)12只。HM組采用高蛋氨酸飲食飼喂造成高同型半胱氨酸血癥； ApoE-/-組和Con組小鼠普通 AIN-93 G 飼料。3組均為室溫 (24±1)℃，濕度 40%～70%，12 h光照/12 h黑暗，3～6只為一籠，自由進(jìn)食、飲水常規(guī)飼養(yǎng)。在相同環(huán)境中飼喂18周后取腦組織檢測。

1.3 血漿Hcy水平測定：3.5%水合氯醛(0.1 mL/10 g) 麻醉小鼠，收集血液置于抗凝 EP 管，室溫靜置 30 min，離心(4 ℃，5 000 r/min)10 min 后，分離上層血漿，裝入 EP管。用 ADVIA 2400 全自動生化儀檢測血漿同型半胱氨酸濃度。

1.4 Nissl體染色：采用Pischinger亞甲藍(lán)法進(jìn)行Nissl體染色，石蠟切片常規(guī)脫蠟到水，亞甲藍(lán)10 min，分化液2 min，鉬酸銨溶液5 min，蒸餾水沖洗，常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡觀察，在高倍鏡(400×)下采圖，采用圖像分析軟件測定光密度值 (OD)，取平均光密度值(MOD)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 TUNEL：神經(jīng)元細(xì)胞凋亡采用 TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒，按照產(chǎn)品使用說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。在高倍鏡下采圖，計(jì)數(shù)高倍鏡下TUNEL陽性的細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算出TUNEL陽性細(xì)胞比例：TUNEL陽性細(xì)胞/TUNEL陽性細(xì)胞+TUNEL陰性細(xì)胞。

1.6 qPCR檢測：RNA的提取，取每組小鼠腦額葉組織用PBS沖洗2次后，加入1 mL Trizol(invitrogen)溶液，吹打混勻充分裂解，室溫靜置5 min，加入相同體積的苯酚，顛倒混勻后加入相同體積的氯仿，-20 ℃靜置至4 ℃，14 000 g離心15 min，去上清液，加入DEPC水溶解沉淀。檢測純度后逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，混合均勻后孵育。根據(jù)mRNA設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行qPCR檢測，實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系如下。

總體積按20 μl的體系配置：ddH2O，8 μl，SYBR Green PCR Master Mix 10 μl(TOYOBO)(使用前需振蕩均勻)，上游引物1 μl,下游引物1 μl，見表1。

表1 引物序列及反應(yīng)體系

2結(jié)果

2.1 血漿Hcy：野生型ApoE空白對照組Hcy為(6.15±2.31)μmol/L，ApoE-/-空白對照組(ApoE-/-)為(10.15±3.03)μmol/L，ApoE-/-實(shí)驗(yàn)組為(18.87±6.79)μmol/L。實(shí)驗(yàn)組血漿Hcy含量明顯增加，與對照組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1-5(封三)。

2.2 組織病理學(xué)變化：組織病理學(xué)檢查可見，各組小鼠腦組織基本結(jié)構(gòu)存在，未見明顯的水腫、壞死、神經(jīng)元缺失等改變，神經(jīng)元分布和形態(tài)未見明顯變化。在對照組和HM組額葉腦組織(圖2,目錄后)，均可見到豐富的神經(jīng)細(xì)胞，Con組和ApoE-/-組偶見固縮神經(jīng)元(圖2A，圖2B,目錄后)。與對照組比較，實(shí)驗(yàn)組的固縮神經(jīng)元有所增加(圖2C,目錄后)。

2.3 Nissl小體和細(xì)胞凋亡:Pischinger亞甲藍(lán)染色結(jié)果顯示(圖3A,目錄后)，各組小鼠額葉皮質(zhì)神經(jīng)元均存在比較豐富的Nissl小體(圖3A,目錄后)，經(jīng)光密度測定顯示，3組平均光密度值比較接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3C,目錄后)。TUNEL染色顯示(圖3B,目錄后)，Con組和ApoE-/-組均偶見TUNEL陽性神經(jīng)元，HM組中TUNEL陽性神經(jīng)元明顯增加，HM組TUNEL陽性神經(jīng)元的比例明顯升高(P<0.05)，見圖3D(目錄后)。

2.4 Hes1基因表達(dá):通過qPCR顯示，HM組Hes1基因mRNA的表達(dá)程度明顯高于Con組和ApoE-/-組(P<0.05)，Con組與ApoE-/-組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)見圖4(目錄后)。

2.5 Notch1基因表達(dá):通過qPCR可見，各組均可見Notch1基因mRNA表達(dá)(圖5,目錄后)，HM組Notch1基因mRNA表達(dá)量明顯高于Con組和ApoE-/-組(P<0.05)，Con組與ApoE-/-組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

臨床和流行病學(xué)研究提示，HHcy是人類的常見代謝異常之一，是心腦血管疾病獨(dú)立的危險(xiǎn)因素，與動脈粥樣硬化、腦萎縮、神經(jīng)退行性疾病有密切關(guān)系[1-2]。在本研究中，通過高蛋氨酸飲食在ApoE-/-小鼠成功誘發(fā)了輕度HHcy。組織病理學(xué)檢查顯示，HM組固縮神經(jīng)元有所增加，TUNEL陽性神經(jīng)元比例明顯增加。本研究結(jié)果提示，在ApoE-/-小鼠輕度HHcy可誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡增加，該結(jié)果與以往研究基本相同[6]。

HHcy能夠加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)神經(jīng)退行性疾病的發(fā)展[1，7-8]。但是，HHcy所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害的作用機(jī)制尚不清楚。本研究在ApoE-/-小鼠中可見，輕度HHcy條件下，腦組織Hes1 和Notch1基因mRNA表達(dá)明顯增高。該研究結(jié)果的意義尚不清楚，同時(shí)，Hes1 基因mRNA表達(dá)上調(diào)與以往Hes1基因蛋白表達(dá)的研究結(jié)果不一致[6]。這可能與HHcy的程度不同有關(guān)，在輕度HHcy升高時(shí)Hes1 基因mRNA表達(dá)上調(diào)，中度和重度HHcy時(shí)Hes1 基因蛋白表達(dá)下調(diào)[6，9-10]。但是，其中確切的變化及其意義，尚需要更多研究證明。

Hcy是腺苷蛋氨酸酶水解反應(yīng)所生成的一種含硫基單位氨基酸，它不屬于組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸，體內(nèi)不能合成，只能來源于蛋氨酸的分解[1，5，10]。研究提示，Hcy可作為興奮性氨基酸，增加神經(jīng)元對外源性有害物質(zhì)和氧化損傷的敏感性，從而加重或促進(jìn)損傷的發(fā)生[1，3]。Hcy的毒性機(jī)制也可能是刺激NMDA型谷氨酸受體和親代謝型谷氨酸受體引起[1，11]。近年來研究提示[12-14]，Notch信號通路對于維持體外培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力有重要的意義，其重要成員Hes1 (hairy enhancer of split 1)基因具有促進(jìn)細(xì)胞分化方向選擇的作用[12-13]。本研究結(jié)果顯示，輕度HHcy條件下，HM組額葉神經(jīng)元凋亡增加，腦組織Hes1 和Notch1基因mRNA表達(dá)增高。這提示，HHcy所致的神經(jīng)元損傷可能涉及Hes1和Notch1基因表達(dá)的改變。體內(nèi)Hcy代謝過程復(fù)雜，HHcy對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷具有十分復(fù)雜的過程和機(jī)制[1，5]。因此，要了解高同型半胱氨酸血癥對神經(jīng)細(xì)胞的損傷及其機(jī)制還需要更加深入的研究。