陳 琰，宋夢(mèng)玲，馬小紅，李永麗，馬麗麗，劉春蓮，楊海燕，李彩艷，徐 仙

卵泡在發(fā)育過(guò)程中受多種生長(zhǎng)因子共同調(diào)節(jié)作用，目前大量研究集中在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族成員，包括顆粒細(xì)胞來(lái)源的抗苗勒氏管激素(AMH)，生長(zhǎng)分化因子(GDFs)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs) 、抑制素(INH)、卵泡激素受體(FSHR)以及白血病抑制因子(LIF) 、白細(xì)胞介素(IL-1) 、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)等。近期研究發(fā)現(xiàn)ENA結(jié)合蛋白家族C(MEX3C)與卵巢功能也存在著相關(guān)的聯(lián)系。本研究探討不同卵巢儲(chǔ)備功能人群中MEX3C在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)水平，揭示MEX3C在卵泡發(fā)育過(guò)程中的作用。

1資料與方法

1.1 一般資料:選取2018年1-2019年10月因輸卵管因素首次在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行體外受精(IVF)助孕治療的不孕婦女55例為研究對(duì)象，年齡24～42歲。將納入研究的患者根據(jù)D3生殖激素水平、AHM及基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)分為3組：卵巢儲(chǔ)備正常組20例(A組)，AMH>2 ng/mL，bFSH<10 mLU/mL，bE2<50 pg/mL且AFC>10枚；卵巢儲(chǔ)備升高組20例(B組)，稀發(fā)排卵或無(wú)排卵，高雄激素的臨床表現(xiàn)和或高雄激素血癥，卵巢多囊改變：超聲提示一側(cè)或雙側(cè)卵巢直徑2～9 mm的卵泡>12個(gè)，和(或)卵巢體積4項(xiàng)中符合3項(xiàng)，患者均于門診口服達(dá)英-35治療3個(gè)周期；卵巢儲(chǔ)備減退組15例(C組)，AMH<1.1 ng/mL，bFSH>10 mIU/mL，bE2≥80 pg/mL且AFC≤5枚，符合上述3條中的1條?；颊呔鶠槭状谓邮躀VF，配偶精液化驗(yàn)檢查正常(WHO精液分析標(biāo)準(zhǔn)，第五版)。排除標(biāo)準(zhǔn):子宮內(nèi)膜異位癥及有反復(fù)性流產(chǎn)病史、既往結(jié)核病史、放化療史、吸煙、麻醉藥品依賴者。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 激素測(cè)定:患者空腹肘靜脈血測(cè)定血清卵泡刺激素(FSH)、黃體生成素( LH)、睪酮(T)、雌二醇(E2) 、孕激素(P)、泌乳素 (PRL)、AHM水平。

1.2.2 IVF方案[1]：卵巢儲(chǔ)備正常組及卵巢儲(chǔ)備升高組患者均采用黃體中期長(zhǎng)方案，降調(diào)藥物均采用長(zhǎng)效曲普瑞林(法國(guó)益普生制藥有限公司)，于月經(jīng)周期第2 ～5 d 啟動(dòng)促性腺激素(Gn)；陰道B超監(jiān)測(cè)卵泡調(diào)節(jié)Gn用量，當(dāng)雙卵巢有2個(gè)卵泡平均直徑≥18 mm時(shí)，給予HCG 5 000～10 000 U，肌肉注射，35～36 h后在陰道B超聲引導(dǎo)下取卵。卵巢儲(chǔ)備減退組患者采用拮抗劑方案，月經(jīng)周期第3～5 d開(kāi)始給予 Gn 150～225 IU/d；GnRH-A：在卵泡直徑>14 mm 或Gn第6天，或血LH>10 mIU/mL或血LH/基礎(chǔ) LH>3 mIU/mL時(shí)，立即皮下注射思則凱0.25 mg/d至HCG日，注射HCG 35～36 h后在陰道B超聲引導(dǎo)下取卵。

1.2.3 檢測(cè)方法:采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清 FSH、LH、E2、PRL、T、AMH。采用Western blotting檢測(cè)MEX3C的表達(dá)水平。經(jīng)陰道B超引導(dǎo)下穿刺18～20 mm 直徑的卵泡，收集患者全部卵泡液，離心 300×g，10 min，分離顆粒細(xì)胞，提取蛋白，定量。用0.22NC μm膜，5%脫脂奶粉溶于TBS-T，室溫20 ℃，搖床封閉 1.5 h，按一定比例稀釋于Western專用一抗、二抗稀釋液，置4℃冰箱，搖床搖動(dòng)過(guò)夜；TBS-T洗膜3次，每次10 min。二抗?jié)舛龋篐RP-羊抗兔(1∶5 000)，HRP-羊抗小鼠(1∶5 000)稀釋于Western一抗二抗稀釋液，置4 ℃冰箱，搖床搖動(dòng)2 h。TBS-T洗膜3～5次，每次15 min，加ECL工作液于印跡膜上30～60 s，吸干發(fā)光液，置印跡膜于成像分析儀自動(dòng)成像，每組樣本隨機(jī)取3例混合，共檢測(cè)3次，軟件Image J分析蛋白條帶灰度值。一抗MEX3C購(gòu)于美國(guó)Proteintech公司。

2結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較：3組患者不孕年限、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；卵巢儲(chǔ)備減退組患者年齡及bFSH顯著高于卵巢儲(chǔ)備正常組及卵巢儲(chǔ)備升高組，卵巢儲(chǔ)備減退組AMH顯著低于卵巢儲(chǔ)備正常組及卵巢儲(chǔ)備升高組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 3組患者臨床資料的比較

2.2 顆粒細(xì)胞中MEX3C在3組不同卵巢儲(chǔ)備功能患者中的表達(dá)：經(jīng)組間比較，卵巢儲(chǔ)備降低組MEX3C表達(dá)水平明顯低于卵巢儲(chǔ)備正常組(P<0.05)；卵巢儲(chǔ)備升高組MEX3C表達(dá)水平明顯高于卵巢儲(chǔ)備正常組(P<0.05)，見(jiàn)圖1(封三)。

3討論

MEX3C是一種有兩個(gè)KH RNA結(jié)合域的 RNA結(jié)合蛋白，還包括一個(gè)具有E3泛素連接酶活性的鋅指結(jié)構(gòu)。有研究發(fā)現(xiàn)MEX3C在肝臟、肌肉和脂肪組織中呈低表達(dá)，而在睪丸、卵巢、腦和發(fā)育的骨中呈高表達(dá)[2]。前期我課題組通過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育卵泡的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中MEX3C呈高度表達(dá)，但在卵泡膜細(xì)胞中低表達(dá)或沒(méi)有表達(dá)，并且該基因還參與了早期胚胎發(fā)育和維持成人生殖系的全能性[3]，以上結(jié)果均表明 MEX3C 在卵泡發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，MEX3C蛋白位于小鼠卵巢顆粒細(xì)胞的胞質(zhì)與胞核，可調(diào)控IGF-1，且MEX3C基因敲除小鼠的生長(zhǎng)軟骨板及血IGF-1均呈下降趨勢(shì)[2-3]。雜合及純合突變小鼠 MEX3C mRNA的表達(dá)水平分別是正常小鼠的 55%和2.2%，純合突變小鼠最明顯的表現(xiàn)是生長(zhǎng)遲緩及成年期身體長(zhǎng)度的顯著降低。雌性小鼠在注射 hCG 12～24 h 排卵，明顯遲于正常小鼠，顯示MEX3C突變小鼠卵泡發(fā)育存在障礙[2，4]。MEX3C的這種表達(dá)模式與IGF-1非常類似，而IGF-1可在卵泡發(fā)育的不同階段可促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖[5]，故推測(cè)IGF-1的缺乏可能是MEX3C突變小鼠卵泡發(fā)育受損的原因之一。在卵巢的顆粒細(xì)胞區(qū)，IGF-1與FSH也可相互促進(jìn)對(duì)方受體的表達(dá)，從而增強(qiáng)相互間的生物效應(yīng)[2，6-7]。

卵巢儲(chǔ)備功能包括卵巢皮質(zhì)區(qū)產(chǎn)生的卵子數(shù)量和質(zhì)量。卵巢儲(chǔ)備功能降低不但可導(dǎo)致卵巢產(chǎn)生卵母細(xì)胞的能力減弱，而且使得卵母細(xì)胞質(zhì)量也隨之下降，進(jìn)而能引起生育能力下降。本研究結(jié)果顯示，不同卵巢儲(chǔ)備功能患者卵子顆粒細(xì)胞中MEX3C表達(dá)水平具有顯著性差異，這也印證了前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，隨著MEX3C表達(dá)量的增加，預(yù)示著良好的卵巢儲(chǔ)備功能及反應(yīng)性。后期課題組將繼續(xù)進(jìn)行IGF-1在顆粒細(xì)胞中表達(dá)的相關(guān)研究，探究其與MEX3C的關(guān)聯(lián)性，為評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能、預(yù)防卵巢儲(chǔ)備功能減退、促進(jìn)卵泡發(fā)育提供理論依據(jù)。